研究背景

鸟类血孢子虫 (avian haemosporidians) 是人疟原虫的近缘物种且为从共同祖先较早分化出的一支 (Galen et al., 2018)，数十年来一直是研究疾病传播机制和种间协同演化的模式类群 (Rivero and Gandon, 2018)。鸟类血孢子虫主要包括疟原虫属 (Plasmodium)、血液变形虫属 (Haemoproteus) 和住白细胞原虫属 (Leucocytozoon) 等，由蚊、蠓和蚋等双翅目 (Diptera) 吸血昆虫传播 (Valkiūnas, 2005)，是鸟类中最常见的血液寄生虫 ( Rivero and Gandon, 2018; Dunn and Outlaw, 2019)，当前基于线粒体细胞色素b基因 (cyt b) 条形码序列定义的谱系支 (lineage) 已超过4,000个，在全球除南极洲以外的所有地区感染了约2,000种鸟类宿主 (Bensch et al., 2009)，并对被感染鸟类的健康乃至生存造成严重威胁。这些血孢子虫谱系支所感染的宿主种类与地理分布范围不尽相同，其中大部分感染病例 (infection cases) 为能感染多种鸟类宿主的泛性寄生虫 (或称为广宿主寄生虫，generalist parasite) 所引发。对泛性寄生虫如何适应不同的宿主这一问题的解答，是揭示宿主和寄生虫协同演化关系的关键。
    由于鸟类宿主行为和免疫功能的差异，泛性血孢子虫对不同鸟类宿主的适应能力并不相同 (Fenton et al., 2015)，通常表现在感染率 (prevalence) 和感染强度 (infection intensity) 两方面。感染率即鸟类种群中被感染个体的比例，反映了寄生虫感染宿主的能力；感染强度即血孢子虫在鸟类宿主体内的种群数量，以被感染红细胞的比例衡量(Pigeault et al., 2015)，反映了寄生虫在宿主体内繁殖的能力。
    传统的血孢子虫检测方法是在显微镜下观察鸟类血涂片，根据血细胞中寄生虫配子母细胞或裂殖体 (仅疟原虫) 的大小、形状、位置、色素排列等一系列形态特征对其进行分类鉴定；并通过对数百个视野中被感染细胞的直接计数获得血孢子虫的感染强度 (Valkiūnas, 2005)。血涂片镜检法对检测者经验和血涂片质量的要求较高，且灵敏度有限，而野生鸟类的感染强度通常较低，因此常出现假阴性结果。此外，镜检法很难区分形态特征极为相似的隐存种，尤其对隐存种众多的疟原虫属，镜检法往往低估了血孢子虫的多样性。
    随着科学技术的发展，基于PCR (Polymerase Chain Reaction) 技术的分子方法逐渐普及，大大提升了检测效率、灵敏度和精确性。本文将分为三个章节，依次介绍基于巢式PCR (nested PCR) 的鸟类血孢子虫系统分类鉴定、基于实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR) 的相对定量检测，以及基于数字式微滴PCR (digital droplet PCR, ddPCR) 的绝对定量检测方法的实验流程和数据分析方法。

一、基于巢式PCR对鸟类血孢子虫进行系统分类鉴定

研究背景

鸟类血孢子虫物种多样，能感染的宿主种类和数量也各不相同。因此，对血孢子虫进行准确的系统分类鉴定是研究其与宿主相互关系的基础。随着分子生物学的发展以及技术的不断完善，2000年，基于聚合酶链式反应 (PCR) 技术的分子鉴定方法首次被用于鸟类血孢子虫的研究 (Bensch et al., 2000)，该方法对血孢子虫线粒体基因组细胞色素b基因 (cyt b) 的479 bp的片段 (条形码片段) 进行扩增和测序分析，在该片段出现一个碱基的差异便会被认定为不同谱系支 (lineages)。在此基础上改良的巢式PCR则进一步提高了扩增的可靠性和灵敏度 (Hellgren et al., 2004)。巢式PCR使用两对引物依次进行PCR扩增 (图1)。第一轮扩增的靶序列略长于条形码片段，第二轮则以第一轮扩增的产物为模板，用两对引物分别对目标片段进行再次扩增。其中一对引物 (HaemF-HaemR2) 适用于疟原虫属和血液变形虫属寄生虫的扩增和物种鉴定，另一对 (HaemFL-HaemR2L) 则适用于住白细胞原虫属。如果第一轮扩增产生了错配，第二轮扩增中错误片段与引物结合的概率极低。因此，相比单一PCR，巢式PCR大大提高了扩增的特异性。同时由于两次富集使目标片段大量扩增，巢式PCR的灵敏度也高于单一PCR。研究表明，即使将野外采集的鸟类血液样品稀释一百多倍，巢式PCR仍然能够准确鉴定出阳性个体 (Waldenström et al., 2004)。


图1. 巢式PCR引物及其目标序列（引自 Hellgren et al. (2004)，已授权）

    本方法一经面世便得到广泛应用，目前已发表的基于此方法鉴定的鸟类血孢子虫谱系支的条形码序列、感染的鸟类物种、地理分布等信息均收录于MalAvi数据库中 (Bensch et al., 2009)。将血孢子虫条形码序列与数据库进行比对便可对其进行系统分类学鉴定。
    本文介绍了利用巢式PCR鉴定鸟类血孢子虫和通过序列比对进行系统分类鉴定的详细流程。

材料与试剂

1. 移液器吸头 (AxyGen，加利福利亚，美国，0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 1.5 ml离心管 (Eppendorf，德国)
3. PCR管或96孔板 (Eppendorf)
4. 96孔板封膜或硅胶盖 (Eppendorf)
5. 50 ml试剂槽 (BBI，catalog number: F619711)
6. Premix TaqTM酶 (Takara，日本， catalog number: RR330A)
7. DNA分子量标准Marker (生工，上海，DL2000，catalog number: B500350)
8. 50× TAE 缓冲液 (生工，catalog number: B548101)
9. 琼脂糖 (生工，catalog number: A620014)
10. 引物3对 (由测序公司合成，见表1)
    
    表1. 巢式PCR引物信息

    	引物名称	引物序列 (5'-3')
    第一轮	HaemNFI	CATATATTAAGAGAATTATGGAG
    	HaemNR3	ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC
    第二轮 (住白细胞原虫)	HaemFL	ATGGTGTTTTAGATACTTACATT
    	HaemR2L	CATTATCTGGATGAGATAATGGHGC
    第二轮 (疟原虫/血液变形虫)	HaemF	ATGGTGCTTTCGATATATGCATG
    	HaemR2	GCATTATCTGGATGTGATAATGGT

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf，德国，量程 0.1-2.5 μl, 1-10 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
2. 离心机 (Eppendorf Centrifuge 5810R)
3. PCR仪 (Applied Biosystems，加利福利亚，美国，catalog number: 435786)
4. 微波炉
5. 电泳仪 (Bio-Rad，加利福利亚，美国)
6. 凝胶电泳成像仪 (基因有限公司，香港)
   

分析软件

1. Genious (Biomatters, Ltd. https://www.geneious.com/)
2. R (R Core Team, https://www.r-project.org/)

实验步骤