研究背景

真核细胞通过将基因组DNA与组蛋白折叠形成核小体，核小体再进一步进行不同层次的折叠组装成染色质，这些精密的组装信息在基因转录调控中起决定性作用。染色质区域的开放性是特异性反式作用因子和顺式调控元件相互作用的前提，基因表达的异常或染色质调控因子的改变都将对细胞的命运产生深远的影响 (Schwartzentruber et al., 2012; Tsompana and Buck, 2014)。美国William J. Greenleaf开发的ATAC-seq技术 (Buenrostro et al., 2015) 是鉴定转录调控序列有效方法。该技术所需的生物样本量小 (只需大约50,000个细胞)、建库流程简单 (约4 h)、重复性高、灵敏度高、并能一次性获得全基因组开放染色质的信息等优点，因此，该技术在昆虫研究中的应用也越来越广泛；例如，帝王蝶大脑调节昼夜转录节律的基因调控模式 (Lugena et al., 2019)、鹿眼蛱蝶翅膀变态发育过程中染色质动态变化 (van der Burg et al., 2019)、蚊子的染色质结构和功能 (Lezcano et al., 2020)、果蝇神经元活性调控基因的鉴定 (Chen et al., 2016) 等。
本研究参考William J. Greenleaf等 (Buenrostro et al., 2013; Buenrostro et al., 2015; Lewis and Reed, 2019) 的方法对非模式动物蝴蝶幼虫进行了ATAC-seq文库的构建。

材料与试剂

1. 移液吸头
2. 离心管
3. 一次性培养皿
4. Corning cell strainer 40 µm Nylon (BD, catalog number: 352340)
5. 无水乙醇 (Merck, catalog number: 459844-2.5 L)
6. TE buffer (pH 8.0) (Solarbio, catalog number: T1120)
7. Nuclease-Free water (NEB, catalog number: B1500S)
8. DEPC H₂O (Invitrogen, catalog number: AM9915G)
9. 1×Phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.2) (Cell Signaling, catalog number: 9872L)
10. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200056)
11. Calf serum (ExCell, catalog number: NCD100)
12. TruePrep™ DNA Library Prep Kit V2 for Illumina (Vazyme, catalog number: TD501-01/502-01/503-01)
13. MinElute PCR purification kit (Qiagen, catalog number: 28004)
14. Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter, catalog number: A63881)
15. Qubit dsDNA HS Assay kit (Invitrogen, catalog number: Q32851)
16. Agilent High Sensitivity DNA kit (Agilent, catalog number: 5067-4626)
17. Lysis缓冲液 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (Merck, catalog number: T2694), 10 mM NaCl (Diamond, catalog number: A100241-0500), 0.2% IGEPAL CA-630 (Merck, catalog number: I8896))
    

仪器设备

1. 解剖刀
2. 解剖剪
3. 镊子
4. 血球计数板
5. DynaMagTM-2磁力架 (Invitrogen, catalog number: 12321D)
6. 恒温水浴摇床 (GFL 1092, Germany)
7. 冷冻离心机 (Eppendorf, catalog number: 5810 R)
8. 体视显微镜 (Nikon, catalog number: SMZ745)
9. ProFlex PCR System (Thermofisher, catalog number: 4484075)
10. Qubit^TM 4 荧光计 (Invitrogen, catalog number: Q33238)
11. Agilent 2100 Bioanalyzer System (Agilent, catalog number: G2939BA)
    

实验步骤