General Pipeline and Advanced Analysis of mRNA-Seq Differential Expression

研究背景

        利用mRNA-Seq技术测得两组或多组样本的转录组数据，并通过差异表达分析和对所发现的差异表达基因集合进行功能富集分析以推断其生物学功能，是包括动物进化研究领域在内的诸多生物学领域中被普遍应用的重要研究思路。针对此类分析流程的方法介绍目前已有很多，包括中文文章 (赵 婧和刘 南，2019)。
        然而，mRNA-Seq的实验设计往往没有被重视，与研究结果准确性息息相关的参数没有被科学严谨的选择，例如样本量和测序深度。功效分析可以帮助研究者了解既定实验在真实存在组间差异时可以统计检验出显著性差异的几率，从而有助于实验设计和对实验结果的解释。此外，实验得到的转录组数据可能由于实验前未知原因或实验中无法控制的变量出现分层的情况。这种情况更可能出现在野生动物样本的数据中，因为野外采集的样本比实验室中收集的样本更难控制各类条件。针对这种情况进行分层分析可以厘清导致分层的原因并在此基础上对数据进行分组，再基于分组后的数据进行差异表达分析。
        本文首先介绍mRNA-Seq转录组差异表达分析目前被普遍应用的一般流程，其中侧重于介绍之前中文文章 (赵 婧和刘 南，2019) 中未提及或简略提及的内容，与其互为补充。之后会针对上述两个问题介绍功效分析和分层分析的方法，以期会有助于包括动物进化领域在内的生物学研究。本文基于作者本人以第一作者于2019年发表于eLife期刊 (Xie et al., 2019)，以及第一作者兼通讯作者于2020年发表于PLoS Computational Biology期刊 (Xie et al., 2020) 的两篇开放获取 (open access) 文章中的相关内容。

仪器设备

1. Linux系统服务器 (理论上几乎当前任何配置的服务器均可以完成分析，但是读者需根据实际数据量使用相应性能的服务器；作者进行上文提到文章中的数据分析所使用的服务器配置相对比较高，即具备20个计算节点且每个节点有512GB内存和32个2.1GHz的CPU核，这样只利用部分计算资源就在很短的时间内完成了分析)。
2. 个人电脑，系统不限，用于运行R软件。此非必须，可在服务器上运行R软件。
   

软件版本信息及下载地址

        此处所列软件及其版本为下文实验步骤中及本文所基于的两篇文章中所使用的。其它相关软件及其下载地址见实验步骤中所涉及处。建议读者在实际研究工作中使用所有软件的最新版本。

1. FastQC (0.11.4, "https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/").
2. Trimmomatic (Bolger et al., 2014) (0.35, "http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic").
3. HISAT2 (Kim et al., 2019) (2.0.4, "http://daehwankimlab.github.io/hisat2/").
4. SAMtools (Li and Durbin, 2009) (1.3.1, "http://www.htslib.org/").
5. HTSeq (Anders et al., 2015) (0.6.1p1, "https://htseq.readthedocs.io/en/master/").
6. R (3.3.1, "https://www.r-project.org/").
7. DESeq2 (Love et al., 2014) (1.14.1, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html").
8. GOseq (Young et al., 2010) (1.38.0, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html").
9. RnaSeqSampleSize (Zhao et al., 2018) (1.6.0, "https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RnaSeqSampleSize.html").

实验步骤