CRISPR/Cas9 Gene Editing Technology in Butterflies and Beetles

实验原理

CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断与crRNA配对的序列靶位点的双链DNA，从而实现对靶标基因的编辑功能(Hsu et al., 2013; Hwang et al., 2013)。通过人工设计这两种RNA，融合形成一条具有引导作用的sgRNA (small guide RNA)，同样可以引导Cas9靶向剪切 (Bassett et al., 2014)。CRISPR/Cas9系统的高效基因编辑功能已被应用于多种生物如:果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyx mori)、蝴蝶(Papilio xuthus, Papilio machaon, Kallima inachus, Bicyclus anynana, Junonia coenia)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、萤火虫(Abscondita terminalis)、飞蝗(Locusta migratoria)、斑马鱼(Danio rerio)及各种动物植物中(Wang et al., 2013; Li et al., 2015 and 2017; Chen et al., 2016; Yang et al., 2020; Zhang et al., 2020; Liu et al., 2021)。

实验目的

利用CRISPR/Cas9系统对靶基因 (蝴蝶：white；萤火虫：Abd-B) 进行编辑，观察基因编辑后的表型变化，验证靶基因的功能。

材料与试剂

1. 滤芯枪头 (Axygen)
2. 玻璃片 (帆船牌，中国)
3. 毛细管1000 × 1.0 × 0.6 mm (BJ-40细玻管，正天易科贸公司，北京)
4. 胶水 (KRAZY，美国)
5. 蝴蝶 (柑橘凤蝶, Papilio xuthus) 成虫
6. 萤火虫 (边褐端黑萤, Abscondita terminalis) 成虫
7. Q5 high-quality DNA polymerase (M0491, NEB)
8. QIAquick PCR Purification kit (28104, Qiagen, Germany)
9. MAXIscript T7 Kit (AM1334, Life technology, USA)
10. Cas9 Protein (CP01, PNA Bio Inc, USA)
11. TransDirect Animal Tissue PCR Kit (AD201, TransGen, China)
12. Trelief^TM Animal Genomic DNA Kit (TSP201, TsingKe, China)
    

仪器设备

1. 0号软画笔、摆卵模具 (7 × 12)
2. PCR仪 (ProFlex PCR System, Life SimpliAmp, USA)
3. 冷冻离心机 (5810 R, Eppendorf, Germany)
4. 37 °C培养箱 (ZQZY-75BN, Shanghai Zhichu instrument Co, China)
5. 干热仪 (BG-thermoRT, Baygene Biotech Co, China)
6. NanoDROP (NANODROP 2000C, Thermofisher, USA)
7. 拉针仪 (Sutter Instrument Co, MODEL P-2000, USA)
8. 显微注射仪 (TransferMan NK2 and FemtoJet system, Eppendorf, Germany)
9. 体式显微镜 (SMZ800, Nikon, Japan)
   

实验步骤