Methods for Obtaining Full-length DNA Barcodes Using High-throughput Sequencing

研究背景

在过去十年里，随着高通量测序技术的发展，我们见证了生物多样性研究中方法学和应用的巨大转变，例如采用标准脱氧核醣核酸 (Deoxyribonucleic acid，DNA) 序列用于快速准确地物种鉴定；利用高通量测序技术来分析复杂的环境样品 (如混合样品、环境DNA (eDNA)、无脊椎动物来源的DNA (iDNA) 等)。保存有规范记录信息的DNA条形码参考数据库也在全球科研人员的共同努力下逐渐建立起来。生命条形码数据库BOLD (The Barcode of Life Data systems, http://v4.boldsystems.org/) 已经拥有了大约八百万条条形码序列，覆盖了包含动物、植物、真菌等生物在内的约30万种物种 (2020年2月截止)。丰富的参考条形码数据为物种鉴定、系统进化关系的构建、种间交互作用和群落结构的研究，以及加深对生物多样性的理解提供了坚实的基础。
        全球条形码参考数据库已经为多个生态系统的研究提供了重要帮助。早期的生态及生物多样性研究经常利用Sanger测序方法来进行条形码测序，随着高通量测序技术 (High-Throughput Sequencing Technologies，HTS) 的推广，DNA宏条形码和线粒体宏基因组方法也被越来越多的研究者接受并使用。但是当研究某些新的环境样品时，条形码数据库中参考数据的缺乏仍会使得基于HTS的宏条形码组学研究遭遇瓶颈：得到的序列不能被有效分配到具体的物种，从而无法反应真实的生物多样性组成，使研究者难以深入了解环境的生态关系。
        以昆虫CO1条形码为例，标准条形码获取成本较十多年前显著降低。在不包括样品收集及处理的成本情况下，传统的Sanger测序的平均生产成本约10美元，如果要构建1亿个样品的条形码数据集，则需要10亿美元。人类基因组在最初构建时，大约花费了30亿美元，但随着高通量技术的发展，目前一个基因组的测序成本已经降低为不到600美元。
        先前基于高通量测序技术获取DNA条形码的方法也存在着各自的优缺点 (图1)，比如：基于罗氏454测序平台构建单样品条形码的研究可以通过拼接获得CO1全长条形码，但成本较高；测序读长较短的部分Illumina测序平台也逐渐用于条形码数据的获取，有研究者使用长度为313 碱基对 (base pair，bp) 的CO1条形码进行分析，该方法虽然可以一次性测序获得全长序列，但由于条形码长度较短，因此特异性会显著降低；也有研究者利用两次聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR) 增加标签序列和测序引物，继而通过测序来直接获取全长条形码，但相关操作比较繁琐。在基因组领域，短数据可以利用位置关系被拼接为准确的长片段；根据类似的原理，所在项目组已经专门开发过针对条形码的组装算法，可以被用于组装混合样品中的全长条形码。根据当时的研究背景，我们开发了基于Illumina Hiseq平台和PacBio 平台的HIFI-Barcode方法，可以通过编码引物的方法，得到带有特定标签序列的PCR产物，从而实现一次性获得96个样品的DNA条形码的目标。该方法发表于Liu et al., 2017。HIFI-Barcode 方法有很高的准确性和效率，但是涉及到较为复杂的分析过程，所以我们认为基于高通量的条形码技术仍有提升的空间。随着国产测序仪MGISEQ 2000 推出单端400 bp测序的模块，我们进一步在此平台上开发出了HIFI-SE的方法，可以不需要进行打断，在其后的数据分析阶段，只需要进行扩增子两端序列的简单拼接，就可得到完整的COI条形码序列。该方法发表于Yang et al., 2020。
        以上三种方法相互独立，测序及分析策略不同，但是在前期样品准备，DNA提取和PCR操作等方面基本一致，所以在此操作手册中，我们将三种方法的实施步骤及相关比较纳入其中，方便研究者选择合适的建库测序平台和后续的分析方法。


图1. 高通量获取标准DNA条形码的策略比较，不同实验方案和测序策略 *代表本研究研制的方法策略。图片修改自Yang et al., 2020。A-E 分别代表的研究为 Meier et al., 2016; Shokralla et al., 2015; Cruaud et al., 2017; Liu et al., 2017; Hebert et al., 2018; Yang et al., 2020。

材料与试剂

1. 96孔PCR板 (Axygen，PCR-96M2-HS-C)，1.5 ml离心管 (Axygen)，2.5 μl，100 μl，200 μl，1 ml枪头 (Axygen Filter Tips)
2. 96方孔深孔板 (2 ml，PP MASTERBLOCK®, 96 Well)
3. 封口膜 (AxysealTM sealing film)
4. 琼脂糖 (NET WEIGHT, REGULAR AGAROSE G-10)
5. exTaq DNA聚合酶 (TaKaRa Ex Taq™)
6. dNTP mix (TaKaRa Ex Taq™)
7. 10x primer buffer (TaKaRa Ex Taq™)
8. ddH2O (广州誉维生物科技仪器有限公司Unique超纯水机制)
9. 合成引物 (上海生工)
10. 昆虫裂解液 Insect Lysis Buffer (见溶液配方)
11. 吸附缓冲液Binding Buffer (见溶液配方)
12. 洗脱液Wash Buffer (见溶液配方)
13. 吸附混合液Binding Mix (见溶液配方)
    注：对于DNA提取可根据自身实验室选择合适的方法和试剂主要试剂，本方法主要介绍玻璃纤维板DNA提取法 (Glass Fiber Plate method) 用昆虫腿提取DNA的方法。所用主要试剂见10-13。
    

仪器设备

1. 0.2-2 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl移液枪 (Eppendrof)
2. 台式高速冷冻离心机 (Beckman，AllegraTM 25R Centrifuge)
3. 水浴锅 (DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司) 或者恒温震荡仪 (MS-100 THERMO-SHAKER)，用于组织裂解
4. 96孔PCR仪 (Thermo Fisher)
5. 电泳仪、电泳槽 (DYY-6C型，北京市六一仪器厂)
6. 凝胶成像系统 (BIO-RAD)
   

软件

1. HIFI-barcode-hiseq，适用于Illumina ，MGISEQ等二代测序平台https://github.com/comery/HIFI-barcode-hiseq。
2. HIFI-barcode-pacbio，适用于Pacbio测序平台https://github.com/comery/HIFI-barcode-pacbio。
3. HIFI-barcode-SE400，适用于MGISEQ 2000 SE400 测序平台https://github.com/comery/HIFI-barcode-SE400。

实验步骤