研究背景

"物种起源与演化"是进化生物学的研究主线。在分支系统学 (cladistic) 基础上，随着21世纪分子生物学方法的普及和测序成本的下降，对各主要动物类群的分子系统发育都已完成。这极大促进了相关领域研究，但同时也提出了新问题 (Lee and Palci, 2015; Mooi and Gill, 2010)。例如，基于分子系统发育推断出的单系群的共有衍征 (synapomorphy)，在不少类群中仍然模糊不清 (Mooi and Gill, 2010)。而基于分子和形态的系统发育关系的不一致性，促使人们重新考虑性状演化中的同源关系和趋同进化。显微CT技术是近年来动物学研究中一个新的影像方法，可以无损获取标本内部三维形态信息，并使得研究者能够较快地获取一个中等大小类群内部形态特征；并可在任意切面进行微米级虚拟连续切片，追踪观察特定解剖结构。此外，显微CT在脊椎动物化石研究中也有重要作用，因此可以获得化石内部的形态学数据，并与现生物种的形态特征一起构建混合矩阵展开分析。这些都为传统形态研究注入了新活力。本文简要介绍显微CT的一般原理、实验流程，并列举在现生鱼类研究中的应用实例。

一、概述

显微CT (X-ray microtomography) 是一种基于X射线的三维无损影像方法。"CT"一词来自"computed X-ray tomography"，直译为"计算机X 射线断层扫描"。当X射线照射样品时，由于样品内部电子密度不均匀，穿过样品后的X射线被不同程度的吸收，产生明暗对比因而形成影像，即该样品的X光片 (X-ray radiograph)。而当样品围绕中心轴在180 °或360 °范围内等角度旋转过程中，可获得一系列X光片。根据滤波反投影算法，可以复原X射线穿透样品时所经过的一个水平面 (即"断层") 的二维影像。该数学原理由美国学者Cormark在1963首先报导，英国电器乐器工业公司 (EMI) 研究中心Hounsfield 于1972研制了世界首台CT样机，应用于临床医学检测。Cormark和Hounsfield二人也因此获得1979年诺贝尔生理医学奖 (严洪范，1984)。显微CT则是通过改进X射线源和探测器，使得空间像素分辨率达到微米级 (1-100 μm) 的CT装置。一套显微CT系统包含： X 射线源、样品台/旋转机构、X 射线探测器、控制器和图像工作站。根据X射线源不同，显微CT可以分为基于X线球管的普通显微CT (MicroCT) 和同步辐射显微CT (synchrotron radiation microCT, SR-μCT) (图1)。现在商业MicroCT设备都是基于X线球管。由于X线球管相当于点光源，产生锥形束，具有几何放大效应。当样品距离X光源越近，获得的放大倍数相应越高 (图1B)。所能获得最大视野则由探测器面积决定。SR-μCT则是利用同步辐射作为X射线源。同步辐射是指由同步加速器生成的电子，在真空环境中以近光速曲线运动时，受外加磁场作用后沿切线方向产生的电磁辐射；其光谱波段覆盖从红外到硬X 射线的范围 (冼鼎昌，2005)。同步辐射装置属于大科学设施，目前全世界在运行的第三代同步辐射装置大约30 个左右，主要提供高品质的X射线。与X线球管产生的X射线 (简称普通光源X射线) 相比，具有高亮度、准相干、单色可调等优点。其X光亮度 (单位面积光子数) 是普通光源的2-3个数量级。同时同步辐射X射线是一束准平行光束，具有相干性，可实现相位衬度成像。如前所述，X射线穿透样品时，由于样品内部电子密度的差异而具有不同吸收效应，所获得明暗对比度称为吸收成像；此外，X射线穿过样品后还存在由于不同介质对X射线传播速度差异引起的相位改变，基于相位改变所产生的强度分布则形成X射线的"相位衬度 (phase contrast)"(图2)。轻元素对硬X射线的相移截面大约是吸收截面的1000倍，因此可用来分辨轻元素组成样品内部结构信息 (Wilkins et al., 1996)。
      对动物样品而言，骨、牙齿、耳石是生物体中高度钙化的硬组织。羟基磷灰石 (Ca₁₀(OH)₂(PO₄)₆) 是骨组织和牙齿的主要组成成份，占整个骨组织的60%；而鱼类耳石基本完全由碳酸钙结晶 (文石 (aragonite)、方解石 (calcite)、球霰石 (vaterite)) 组成。普通MicroCT和SR-μCT都可方便的对上述硬组织进行三维成像。而对软骨、肌肉、内脏、脂肪等这些主要由C、H、O、N轻元素组成的软组织，由于它们对X射线的吸收很少，因此相互间的吸收差异很小，普通MicroCT难以区分；而同步辐射X光源则可通过相位衬度成像，清晰区分生物体软组织 (任玉琦等，2013) (图2)。当然现在普通MicroCT成像也可利用碘剂、0.3%磷钨酸等染液进行非特异染色增强肌肉、脂肪等软组织吸收对比度 (Metscher, 2009)。相较于传统MicroCT，SR-μCT具有高光子通量、对软组织有更高的密度分辨率等优点，但视野较小、光斑尺寸偏小，如上海光源BL13W成像线站最大光斑尺寸45 mm (水平) × 5 mm(垂直) (和友等，2013)。在实践中，MicroCT和SR-μCT二者常配合使用。
       显微CT的发展和应用使得研究者可以较快地获取一个中等大小动物类群内部形态特征。同时，根据不同图像灰度值可提取复原骨骼、咽齿、脑等特定器官，并可在任意切面进行微米级虚拟连续切片，追踪观察特定解剖结构，这提供了更多新的内部特征；利用显微CT方法可辅助物种识别鉴定，开展基于内部形态的系统发育关系分析，性状演化研究，并为演化生物学中其它相关理论问题提供形态学素材。这些为传统形态研究注入了新活力。


图1. 显微CT实验装置和流程图 A. 同步辐射显微CT示意图；B. 普通显微CT示意图；C. 实验流程图。SOD：样品到光源点距离；SDD：样品到探测器距离。在普通显微CT实验时，缩小SOD距离，则可提高几何放大倍数。


图2. X射线吸收成像与相衬成像 A. 金鱼的吸收成像；B. 吸收成像原理示意，由于样品内部密度差异导致穿过样品X射线产生明暗对比；C. 同一金鱼的相衬成像；D. 相衬成像原理示意，由于样品对穿过的X射线相位改变引起的衬度对比。(引自 任玉琦等，2013)

二、实验流程与注意事项

显微CT实验一般流程如图1C。不同于光学显微镜或扫描电镜拍摄时所见即所得，显微CT实验直接获得的是一套"投影图" (穿透样品的X光片)，需经重建后得到"断层扫描图"，而后进一步在三维图形软件里 (如Avizo (Amira的升级版本), VG Studio MAX, Mimics等) 进行灰度值分割、渲染、复原分析获得"三维复原图"(最终的3D图像)。在实际操作中，不同厂商的显微CT设备具有不同操作界面和相关参数设置。本文就一些共性的注意事项介绍如下。

1. X射线参数。在普通显微CT实验时，X线管电压和管电流是两个常用参数 (Ketcham and Carlson, 2001)。X线管电压反映所产生X线的能量高低，对应X线对样品的穿透能力；一般而言，相同物理密度的同类样品，标本越大越厚则需要更高的X线管电压；而相同尺寸的样品，物理密度越大则需要更高管电压。管电流则是在同一管电压条件下，反映所产生X光的亮度 (光子数)，管电流越大光子数越多。管电压与管电流有相关性，在商业显微CT设备中，厂商常以管电压作为独立变量，预设一系列参数供实验者选择。对鱼类而言，同其它显微CT测试一致，选取管电压时，在二维投影预览时最强吸收部分的穿透率的参考值一般选择67%，即保证2/3的X光可穿透样品。就同步辐射显微CT而言，产生单色X射线，常以KeV为单位表示，很容易满足对现生鱼类标本的穿透要求。需要指出同步辐射X线比普通X线更亮，但其X线能量并不一定比普通X线高。
2. 投影数与断层扫描图重建。 显微CT实验原始数据来自样品等角度旋转时所获取的一套投影图。在确定好X射线参数后，需对投影图进行设置。首先调整待测定样品位置使其处于投影图的视野范围内，并保证样品在旋转过程中始终位于该视野内；然后设置投影数。投影数多少反映了实验需要旋转多少个角度，如360 °范围内以0.5 °步长进行旋转则获得720张投影图。对同一样品而言，投影数越多重建后得到的断层扫描图中细节越清晰，但投影图数量超过一定数值后，解剖细节不再明显改善而数据量明显增加。因此，在满足所需观察的解剖结构基础上，空间分辨率要求低则投影数可相对较少。在不同厂商的显微CT设备中，或直接设置投影图数量，或是设置旋转步长角度。一般而言一套实验可设置1080张、1440张投影或更多，或是以0.5 °、0.3 °或更小角度的步长进行实验。在同步辐射显微CT实验中，样品在180 °范围内平均旋转步长0.25 °或更小，对应投影数在720张及以上。在上述参数设置好后、正式拍摄前，需拍摄一张没有样品的空白图 (称作"背景图") 作为后继重建时矫正使用。在同批次显微CT实验过程中，X射线管电压参数改变、或投影图视野大小改变后，需重新拍摄背景图；反之则不用。实验完成后，将所获取的一套投影图 (包括背景图) 导入显微CT自带重建软件中，并根据提示输入投影图数量、管电压、样品到探测器距离、空间像素等相关参数进行重建。
3. 断层图图像格式与三维复原分析。重建时输出的断层扫描图一般为8位或16位BMP、TIF、JPG等格式的灰度图。8位灰度图像指用数值0-255 (2⁸-1) 表示全黑到全白间的灰度变化，而16位灰度图像则指用数值0-65535 (2¹⁶-1) 表示全黑到全白间的灰度变化。对于鱼类来说，骨骼、耳石等硬组织在断层扫描图中具有高灰度值、而软组织灰度值较低、空气的灰度值一般最低 (图1C)。获取一套断层扫描图后，则需将其导入三维图形软件中进行复原分析。首先通过调整灰度值阈值可以将不同类型成份区分出来 (即灰度值分割)，随后对感兴趣成份或部位进一步进行着色处理 (伪彩渲染)，并导出保存3D复原图 (图1C)。常用三维图形软件如Avizo (Amira的升级版本), VG Studio MAX, Mimics等有各自教程，本文不进行展开。需注意两点，一是一些显微CT设备所带断层扫描图重建软件直接输出专业格式文件，如GE phoenix 系列显微CT重建后常直接输出一个.vol、.vgl格式文件, 只有在VG Studio软件中打开，因此实验者需与操作人确认输出的图像方式是一个特殊格式文件还是一套.BMP或.TIF格式的断层扫描数据 (image stack)，以便实验人员后继分析。二是一套显微CT的断层扫描图数据量常在Gb级别，一套16位灰度图形数据比同样一套8位灰度数据大一半左右，因此根据实际需求和电脑计算能力选择输出是采用8位或16位图像格式。
4. 样品放置。大部分商业显微CT和同步辐射显微CT，都是X射线源和探测器位置固定、样品竖直放置于样品台上旋转。由于显微CT实验是通过对待测样品不同角度X线投影图进行重构完成，因此要求样品在测试旋转过程中不能有其它位移，样品需要固定好、不能有轻微晃动。对鱼类而言，一般根据鱼体大小竖直装入合适大小塑料管中 (如1.5-15 ml 塑料离心管、50 ml平底离心管)，塑料管底部再用双面胶黏贴在样品台上。如对较大标本，也可用塑料膜包裹后捆扎结实，立于样品台上。在样品旋转过程中在试管内鱼类标本有空间位置的任何移动，将无法正确重建断层图像，所获得结果或是样品边缘不闭合或是图像失真。此外，现在一些商业显微CT类似医院医学CT设备(例如Brucker公司Skycan1176、Skyscan1276型号)，样品放置于水平样品床上，X射线源与扫描系统旋转围绕样品床旋转。对于床式显微CT，由于鱼体或多或少带有液体 (水分)，需包裹一层塑料膜放置于样品床上。
5. 标本处理。显微CT实验对鱼类标本本身没有特殊要求，酒精保存标本或福尔马林保存标本都可以。我国高校、研究所等科研机构的鱼类标本库在90年代以前，常用福尔马林溶液保存；21世纪后，大部分研究机构采用福尔马林溶液固定后转入酒精保存，或直接酒精溶液中保存。无论是福尔马林溶液还是酒精溶液标本，并不影响显微CT实验；如笔者所测定的最早样品为上海海洋大学鱼类标本馆中伍汉霖教授于1955年采集的竿虾虎标本，其仍保存完好骨骼细节 (He et al., 2015)。但需指出，由于福尔马林溶液(即甲醛溶液)，长期放置会被部分氧化为甲酸，有脱钙作用。笔者遇到2000年后采集的鲤科、鳅科标本外形保存完整，但显微CT实验时观察不到明显的骨骼。此时对影像数据解释，不应是软骨化，而可能是由于保存液酸化造成的脱钙现象。
   
   

三、应用实例

1. 钩头鱼头角结构的个体发育
   钩头鱼 (Kurtus gulliveri Castelnau, 1878) 是产于大洋洲的河口鱼类，具有雄性育幼行为。其成年雄性的头部具有一个头角结构，雄鱼利用头角悬挂受精卵块直至其孵化出鱼苗 (Berra and Neira, 2003)。笔者通过对一系列钩头鱼仔/稚鱼和成鱼 (10-200 mm standard length, SL) 的脑颅结构显微CT成像，对其头角个体发育进行了研究 (He et al., 2016)。结果显示，钩头鱼无论雌雄，上枕嵴骨板内部存在一缝隙样腔室；根据此腔室，可将其上枕嵴划分为嘴端、中段，尾端三部分 (图3A)。这一腔室在钩头鱼后弯曲期仔鱼晚期 (late postflexion larvae) (> 15 mm SL) 已出现，在100 mm SL左右亚成体雄鱼时期，嘴端部分被吸收，而中段背前侧向前生长，形成头角；此前组织学研究显示上枕嵴腔体内有血管侵入 (Berra and Humphrey, 2002)。其姐妹类群天竺鲷科鱼类和绝大多数鲈形目鱼类上枕嵴中没有此腔室，因而是钩头鱼的高级自近裔特征 (autopomorphy)。该研究涉及了同步辐射显微CT、商业化显微CT、及自研型显微CT，具有一定方法学借鉴意义；根据鱼体大小，相关实验如下。对< 30 mm SL 的仔稚鱼进行同步辐射显微CT实验，实验于中国科学院上海同步辐射大科学装置完成，标本装于1.5 ml离心管内，以塑料泡沫填充固定。离心管以双面胶竖直固定于样品台上。实验时选用18 keV单色同步辐射X线，以0.25 °步长旋转180 °，获取一套720张投影图的数据集，经重建后获得断层扫描图。空间分辨率5.2 μm 或3. 25 μm。对30 mm < SL < 200 mm 的标本，采用Skyscan1176型显微CT (Brucker公司)，50 kv管电压，0.3 °步长旋转。对> 200 mm SL成体采用 中科院古脊椎动物和古人类研究所225型自研显微CT完成，样品用保鲜膜包裹，埋藏于塑料泡沫裹紧后，竖直于样品台上。实验时管电压80 kv，以0.5 °步长旋转360 °，获取720张投影图，空间分辨率为30 μm或36 μm。
   
   
   图3. 钩头鱼上枕嵴和头角结构显微CT复原 (嘴端向左) A. 成年雌鱼上枕嵴，可分为嘴端、中段、尾端三部分；B. 成年雄鱼的上枕嵴和头角结构；C-G. 钩头鱼幼鱼 (～30 mm SL) 显微CT实验后虚拟切片和上枕嵴部位三维复原，C-F. 依次经嘴端、中段、尾端的代表性虚拟切片；H-K. 天竺鲷成鱼显微CT实验后虚拟切片和上枕嵴部位三维复原，H-J. 依次经嘴端、中段、尾端的代表性虚拟切片。C图中箭头显示上枕嵴骨板内部腔室；A, B, G图钩头鱼上枕嵴中段腔室复原后以绿色渲染展示；K 天竺鲷上枕嵴为一骨板 (无腔室)；C-G来自SR-μCT实验，其它来自普通MicroCT实验。(引自 He et al., 2016)
   
   
2. 基于分子与骨骼形态的沙塘鳢科系统发育
   "虾虎鱼"是一类全球性分布的的小型鱼类，已知超过2,200种。《中国动物志 (硬骨鱼纲) 》中将其列为虾虎鱼亚目 (Gobioidei) (伍汉霖和钟俊生，2008)，而Fishbase 网站则将其列为虾虎鱼目 (Gobiiformes)，二者均指向同一个在海洋和淡水中辐射适应的自然类群。虾虎鱼亚目的组成和科一级的分子系统发育关系已基本完成(McCraney et al., 2020; Thacker, 2009; Thacker and Hardman, 2005)，分布于东亚地区淡水河流中的沙塘鳢科与东南亚淡水溪流中的溪鳢科形成姐妹群，是虾虎鱼亚目的基干类群。沙塘鳢科首先由Hoese 和 Gill于1993年建立，他们根据头部感觉管排列、是否有"眶下骨" (suborbital；该骨片不同于鲤科的infraorbital)、肩胛骨发达程度等特征将塘鳢科中3个属：小黄黝鱼属 (Micropercops Fowler and Bean, 1920)、沙塘鳢属 (Odontobutis Bleeker, 1874)、鲈塘鱧属 (Perccottus Dybowski, 1877) 独立成沙塘鳢科，此后新沙塘鳢属 (Neodontobutis Chen, Kottelat and Wu, 2002)、华黝鱼属 (Sineleotris Herre, 1940)、"海南细齿塘鱧 (Philypnus Chalmersi Nichols and Pope, 1927) "、怪沙塘鱧属 (Terateleotris Shibukawa et al., 2001) 陆续被归入沙塘鳢科；但沙塘鳢科的组成和系统发育此前尚缺乏系统研究。上海海洋大学研究团队新近利用基因富集技术和显微CT方法对沙塘鳢科名下所有属和相关类群 (除产自老挝北部怪沙塘鳢未获标本) 进行了分子和形态的综合研究 (Li et al., 2018)。基于4,434个单拷贝核基因位点的分子系统发育表明沙塘鳢科是由小黄黝鱼属、沙塘鳢属、鲈塘鱧属、新沙塘鳢属、华黝鱼属、"海南细齿塘鱧"组成的一个单系群。根据鱼体大小，研究人员进一步选择Skyscan1176型显微CT (Brucker公司) 建立了标准实验流程 (45 kv管电压，0.3 °旋转步长)，获取了6个属的代表物种的8.7 μm像素分辨率的骨骼形态。结果显示，此前Hoese and Gill (1993) 提出的眶下骨 (suborbital) 在沙塘鳢科各属中或存在或缺失，而完全骨化的肩胛骨 (将最上胸鳍鳍基骨与匙骨上端分隔开) 则是一个同源性状，具有系统发育意义 (图4B-图4G)。细齿塘鱧属 (Philypnus Valenciennes, 1837) 被认为是呆塘鱧属 (Gobiomorus Lacepède, 1800) 的次异名 (junor synonym)，而后者是分布在中美洲大西洋和太平洋两岸的热带鱼类。"海南细齿塘鱧"此前分类地位不确定，曾被不同学者归入鲈塘鱧属 (Hoese and Gill, 1993)，或华黝鱼属 (Chen et al., 2002)；在《中国动物志 (硬骨鱼纲)：虾虎鱼亚目》中暂时沿用旧名。而本研究中显示 "海南细齿塘鳢"是沙塘鳢科成员，是"华黝鱼属+小黄黝鱼属"的姐妹群 (图4 A)，具有完全骨化的肩胛骨，因此 "海南细齿塘鱧"被修订为新属 "细齿黝 (Microdous) "。
   
   
   图4. 沙塘鳢科的分子系统发育与肩带骨骼 (左侧肩带侧视图，嘴端向前) A. 基于4434个单拷贝核基因的沙塘鳢科分子系统发育；B. 海南细齿黝(Microdous chalmersi)；C. 小黄黝鱼(Micropercops swinhonis)；D. 萨氏华黝鱼(Sineleotris saccharae)；E. 葛氏鲈塘鳢 (Perccottus glenii)；F. 海南新沙塘鱧(Neodontobutis hainanensis)；G. 鸭绿沙塘鳢(Odontobutis yaluensis)。cl：匙骨，cor：乌喙骨，pr：胸鳍鳍基骨，sc：肩胛骨，scl：上匙骨。(引自 Li et al., 2018)
   
   

致谢

本文得到国家自然基金31672250支持。

参考文献

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