Protocols of UCE Capture and Data Analysis

UCE方法简介

超级保守元件 (Ultra-Conserved Elements, UCE) 是指研究类群基因组中高度保守的区域 (具有 ≥ 80% 的序列相似性，长度 ≥ 100 bp)。基于杂交富集测序技术的超级保守元件 (UCE) 方法，首先通过对比研究类群代表种类的基因组序列筛选上千个超级保守元件，并根据其序列设计探针，然后通过设计的探针对研究类群不同种类中的超级保守元件进行靶向富集，运用高通量测序方法获得大量同源基因位点用于构建研究类群的系统发育树 (具体方法见图1；Faircloth et al., 2012)。UCE序列的高度保守性使其容易在不同种类的基因组中被识别和富集并进行序列比对，而其侧翼 (flanking) 序列的保守性显著降低，往往具有很多系统发育信息位点用于解析类群间的演化关系，因此超级保守元件是系统发育研究的理想目标 (Faircloth et al., 2012)。


图1. 超级保守元件 (UCE) 杂交富集方法简介 (引自Faircloth et al., 2012)

        与其它常见的系统发育基因组学方法 (如全基因组测序及转录组测序方法) 相比，超级保守元件 (UCE) 杂交富集方法具有测序价格相对较低、不必依赖于新鲜标本、可快速获得大量分子数据等特点 (Zhang and Lai, 2020)，在很多类群的研究中被广泛应用，如哺乳动物的胎盘类 (McCormack et al., 2012)、爬行动物的蛇类 (Streicher and Wiens, 2016)、两栖动物的蛙类 (Pie et al., 2019)、辐鳍鱼类和鲶鱼类 (Faircloth et al., 2013; Ochoa et al., 2020)、鸟类 (McCormack et al., 2013) 及其中的夜鸟类 (White et al., 2019)、蛛形纲动物 (Starrett et al., 2017) 及其中的原蛛类 (Hedin et al., 2019) 和跳蛛类 (Maddison et al., 2020)、以及昆虫的弹尾纲 (Sun et al., 2020)、膜翅目 (Faircloth et al., 2015; Branstetter et al., 2017; Cruaud et al., 2020) 和半翅目 (Forthman et al., 2019) 等。研究表明UCE方法不仅适用于较高阶元 (如目、科) 间的系统发育研究 (McCormack et al., 2012; Hedin et al., 2019)，也能成功解决低级阶元 (如近缘种和种群) 间的演化关系 (Ješovnik et al., 2017; Branstetter and Longino, 2019)。此外，近年还在长期保存 (~150年前) 的博物馆标本 (70%-80%乙醇) 中成功获得UCE数据进行系统发育分析，并从UCE测序结果中成功组装出线粒体基因组 (Derkarabetian et al., 2019)。为了解决系统发育基因组学中数据分析的难题，Faircloth, B. C. 针对UCE数据开发了PHYLUCE软件包 (Faircloth, 2016)，并提供了在线指南详细说明UCE数据的分析流程和方法 (https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/)。
本文从超级保守元件 (UCE) 的探针设计、杂交富集实验和数据分析三个方面详细介绍了UCE方法的主要流程，以帮助大家了解和掌握这一方法。针对小型节肢动物 (如小蜂类) 优化的UCE方法请参考 (Cruaud et al., 2018)。此外，系统发育基因组学数据分析需要一定的生信基础，建议大家熟悉一些比较常用的编程语言 (如bash、python等) 的基本操作。

第一部分 UCE探针设计

探针为生物合成的核苷酸序列，用于捕获样品DNA中的目标片段，是基于杂交富集原理的系统发育基因组学研究的关键。目前学者已针对不同动物类群设计了多套UCE探针 (表1)，可根据需要直接从公司 (如Arbor Biosciences；中国独家代理为蓝景科信 (北京) 技术有限公司) 订购适合的myBaits UCE试剂盒进行杂交富集 (https://arborbiosci.com/genomics/targeted-sequencing/mybaits/mybaits-expert/mybaits-expert-uce/)。

表1. 目前已有UCE探针汇总

        有些课题也许需要设计新的UCE探针，在此我们简要介绍UCE探针设计的主要流程，详细方法请参考PHYLUCE的在线教程 (Tutorial IV；Faircloth, 2016)。设计的最终探针序列可提供给生物公司进行合成，并制备相应的探针试剂盒。

软件

1. Conda
   https://anaconda.org/anaconda/conda
   
2. PHYLUCE version 1.6 (Faircloth, 2016)
   https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/
   
3. Python version 2.7
   https://www.python.org/download/releases/2.7/
   
4. FaToTwoBit
   http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/
   
5. Art_illumina version 2.5.1 (Huang et al., 2012)
   https://www.niehs.nih.gov/research/resources/software/biostatistics/art/
   
6. Stampy version 1.0.32 (Lunter and Goodson, 2011)
   https://www.well.ox.ac.uk/research/research-groups/lunter-group/lunter-group/stampy
   
7. SAMtools version 1.10 (Li et al., 2009)
   http://samtools.sourceforge.net/
   
8. BEDtools version 2.28.0 (Quinlan and Hall, 2010)
   https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html
   

实验步骤