Screening and Typing of Symbiotic Wolbachia that Affects Insect Phylogenetic Analysis

研究背景

线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA) 是动物体内唯一存在于核外的遗传信息载体，共价闭合的环状分子，结构简单，进化速率快，母系遗传（但有少量双亲遗传的案例已被证实），是研究低级分类单元较好的分子标记，已被广泛应用于多种动物类群的种群遗传结构、物种鉴定和系统发育等研究 (Gray et al., 1999)。然而，采用mtDNA对一些昆虫进行相关调查的结果却不能正确反映其遗传多样性和物种分类等信息。研究显示，原因可能与一类胞内共生菌Wolbachia Hertig, 1936有关 (Gerth et al., 2011)。
        Wolbachia隶属于α-变形菌纲Alphaproteobacteria，立克次氏体目Rickettsiales、无形体科Anaplasmataceae，是一类广泛存在于节肢动物和线虫生殖组织中，可调控寄主生殖行为的细胞内共生菌 (Riegler and O'Neill, 2006)。据统计学分析，Wolbachia能感染全球约2/3的昆虫物种，是昆虫中分布最广泛的共生菌 (Hilgenboecker et al., 2008)。在细胞中，Wolbachia 和寄主mtDNA都以母系遗传方式传递给后代，Wolbachia能在种群和物种的水平上影响寄主mtDNA的遗传多样性 (Whitworth et al., 2007)。在种群水平上，研究发现Wolbachia的侵染可能会产生"选择性清扫" (selective sweep) 作用，即Wolbachia依赖自身的选择优势在寄主种群内迅速扩散，与其相关联的mtDNA类型在种群中的比例也随之扩大，降低了寄主种群mtDNA多态性水平，从而干扰了mtDNA作为分子标记研究种群遗传结构的分析结果 (Jackel et al., 2013)。在物种水平上，由于同域分布的近缘种间往往存在杂交现象，Wolbachia的感染和传播所产生的"选择性清扫"作用，则可能导致近缘种之间产生mtDNA的渐渗现象 (introgression)，使得核基因水平上关系非接近的种类却具有非常相似的mtDNA单倍型和Wolbachia株型 (Whitworth et al., 2007)。
        本文提供了详细的昆虫共生菌Wolbachia筛查及分型方法，有助于分子系统学实验室在短时间内掌握。该方案的有效性已在鳞翅目分子系统学研究中得以验证，详细结果请参阅 Jiang et al., 2018。

材料与试剂

1.  无菌无酶 EP 管 (1.5 ml，Axygen Scientific公司，Axygen)
2.  无菌无酶移液器吸头 (20 μl、200 μl 和 1000 μl，Axygen Scientific 公司，Axygen)
3.  一次性橡胶手套
4. DNA提取试剂盒 (QIAGEN 公司，Qiagen，catalog number: 51304)
5. 无水乙醇 (上海国药)
6. TE 缓冲液 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司，生工，catalog number: B548106-0500)
7. Taq PCR Master Mix (上海天根)
8. 琼脂糖 (上海天根)
9. Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工，catalog number: SK8132)
10. 核酸染料 (O.P.D)
11. DNA Marker (上海天根)
12. 蛋白酶K (上海天根)
    

仪器设备

1. 无菌剪刀、镊子
2. 移液器 (Eppendorf)
3. 电动研磨仪(天根生化)
4. PCR仪 (Eppendorf)
5. 电泳仪 (上海天能)
6. 凝胶成像系统 (上海天能)
7. 超低温冰箱 (青岛海尔)
8. -20 °C冰箱 (青岛海尔)
9. 小型离心机 (Eppendorf)
10. 恒温水浴锅 (精宏)
11. 高压灭菌锅 (Kagoshima Seisakusyo Inc.)
12. 电子天平 (上海精密)
13. 微波炉 (格兰仕)
14. 纯水仪 (Millipore)
    

实验步骤