研究背景

        传统分子系统学研究往往采用一个或几个基因标记，通过设计PCR引物，扩增目标基因，然后克隆、测序。这种方法耗时费力，一次只能获得一个样本一个或几个基因的序列。随着测序技术的提高和测序成本的不断下降，越来越多的动物系统学和进化研究开始使用基因组水平的数据。但是目前采用全基因组测序的方法成本太高，特别是当研究涉及物种较多或者每个物种有多个样品的情况下。因此，越来越多的研究者通过使用简化基因组或靶基因富集等方法，获得基因组的部分同源序列用于系统学研究。
        简化基因组依靠限制性内切酶位点来选择同源序列，此方法用于遗传距离较远的物种往往不能保证序列的同源性，还可能会导致大量数据的缺失。而通过锚定超保守序列的基因富集方法，如ultraconserved elements (UCEs) 或anchored hybrid enrichment (AHE) 等方法获得的大部分序列是超保守的序列和非编码的侧翼序列。超保守序列提供的系统发育信息不足，而侧翼非编码序列与编码序列相比无论是在序列比对和适用分子进化模型等方面都还不成熟，不太适合用于系统学分析。另外，无论是UCEs还是AHE可用的标记数量有限。本方案介绍一种跨物种靶基因富集技术，通过改变杂交条件，降低杂交和清洗温度等步骤获得相似度低至60-70%的目标基因序列。因此，该方法比UCEs或AHE更具优势，可以用于富集不同物种的编码基因，能更好地用于系统发育基因组学的研究；也可以用于获得非模式物种的目标基因序列，用于基因功能进化的研究。
        本实验方案结合自主开发用于系统发育基因组学研究的分子标记，已成功应用于桑科植物 (Yao et al., 2013)、蚂蚁 (Stroeher et al., 2013)、绦虫 (Huan et al., 2016)、线虫、纤毛虫，鱼类 (Song et al., 2017，Yin et al., 2019)、爬行类和哺乳类等生物类群中。本实验方案尽量采用自配溶液和降低成本的设计，可以一次性获得一百多个样品的几千个基因序列。每个样品建库、富集和测序的总成本可以控制在300-400元。

材料与试剂

一、"MagNA磁珠清洗法纯化DNA"试剂清单

1. 5% Sera-Mag Magnetic Speed-beads (Fishersci，catalog number: 09-981-123，4 °C储存)
   
2. PEG-8000 (生工，catalog number: A600433-0500，常温储存)
   
3. 5 M NaCl (生工，catalog number: A100241，常温存储，自配至对应浓度)
   
4. 1 M Tris-Cl (pH = 8.0) (生工，catalog number: B548127-0500，常温储存)
   
5. 0.5 M EDTA (pH = 8.0) (Invitrogen，catalog number: 15575-020，常温存储)
   
   

二、"靶基因富集文库构建"试剂清单

1. Buffer Tango (10x) (Thermo, catalog number: BY5，-20 °C储存)
   
2. dNTPs (10 mM each) (Invitrogen，catalog number: 18427088，-20 °C储存)
   
3. ATP (100 mM) (Thermo，catalog number: R0441，-20 °C储存)
   
4. T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) (Thermo，catalog number: EK0031，-20 °C储存)
   
5. T4 DNA polymerase (5 U/μl) (Thermo，catalog number: EP0061，-20 °C储存)
   
6. T4 DNA ligase (5 U/μl) (Invitrogen，catalog number: 15224041，-20 °C储存)
   
7. T4 DNA ligase buffer (10x) (T4 DNA ligase试剂盒配套)
   
8. PEG-4000 (50%) (T4 DNA ligase试剂盒配套)
   
9. Bsm polymerase, large fragment (8 U/μl) (Thermo，catalog number: EP0691，-20 °C储存)
   
10. Bsm buffer (10x) (Bsm polymerase, large fragment (8U/μl) 试剂盒配套)
    
11. KAPA HiFi Hotstart Ready Mix (2x) (KAPABIOSYSTEMS，catalog number: KK2602，-20 °C储存)
    
    

三、"靶基因富集"试剂清单

1. UltraPure™ SSPE, 20x (Invitrogen，catalog number: 15591043，常温储存)
   
2. UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 (Invitrogen，catalog number: 15575020，常温储存)
   
3. Denhardt's Solution (50x) (Invitrogen，catalog number: 750018，-5 °C ~-30 °C储存)
   
4. 10% SDS溶液 (生工，catalog number: B548118-0100，常温储存)
   
5. SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μl) (Invitrogen，catalog number: AM2696，-20 °C储存)
   
6. DEPC 处理水 (生工，catalog number: B501005-0500，常温储存)
   
7. RNA baits (Arbor Bioscience，-20 °C储存)
   注：RNA baits是一段带有生物素标记、与目标基因互补配对的RNA序列。通过杂交反应与目标基因结合，其特有的生物素能与链霉亲和素磁珠特异结合，根据此特性清洗去除非目标序列以达到富集效果。RNA baits可以根据目标基因进行设计，例如通过比较模式生物基因组寻找单拷贝核基因编码序列，设计RNA baits (Li et al., 2012)。
   
8. Human Cot-1 DNA (Invitrogen，catalog number: 15279011，-20 °C储存)
   
9. BO1 (封阻片段1，序列见"溶液配制")
   
10. BO3 (封阻片段3，序列见"溶液配制")
    
11. Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 (Invitrogen，catalog number: 65002，2-8 °C储存)
    
12. Binding Buffer (成分见"溶液配制")
    
13. Tween-20 (Amresco，catalog number: 0777-1L，常温储存)
    
14. Wash Buffer2 (成分见"溶液配制")
    
15. Wash Buffer1 (成分见"溶液配制")
    
16. 1x TE buffer (生工，catalog number: B548106，常温储存)
    
17. KAPA HiFi Hotstart Ready Mix (2x) (KAPABIOSYSTEMS，catalog number: KK2602，-20 °C储存)
    
18. 20x SSC 缓冲液 (生工，catalog number: B548109-0200，常温储存)
    
19. 1 M Tris-HCl 溶液，pH 7.5，无菌 (生工，catalog number: B548124-0500，常温储存)
    
20. HPLC超纯水 (TEDIA，catalog number: WS2211-001，常温储存)
    
    

四、其他耗材

1. 0.2 ml 薄壁PCR管 (Axygen，catalog number: PCR-02-L-C)
   
2. 各种型号的带滤芯枪头 (10 μl，100 μl，200 μl，1000 μl，Axygen)
   
3. 0.2 ml 96孔PCR板盒 (淘宝)
   
4. 自制磁板 (超强磁条 (淘宝) 嵌套于0.2 ml 96孔PCR板盒)
   

仪器设备

1. PCR仪 (Eppendorf AG，22331 Hamburg)
   
2. 杂交仪 (UVP HB-1000 Hybridizer)
   
3. 0.1-2.5 μl, 0.5-10 μl, 2-20 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl移液枪 (Eppendorf系列)
   
4. 漩涡混匀仪 (上海沪析实业有限公司，Vortex-2)
   
5. 微型掌上离心机 (上海沪析实业有限公司，HL-6KS)
   
6. Nanodrop 3300超微量荧光分光光度计 (Thermo)
   
7. 破碎仪 (Covaris M220)
   
8. 高压蒸汽灭菌锅 (上海博讯实业有限公司)
   
9. 服务器 (Linux系统，32 G以上的内存，500 G的存储)
   
10. 电泳仪 (BIO-RAD，PowerPac-Basic)
    

分析软件

1. Perl v5.18 or higher (https://www.perl.org/get.html)
   
2. trim_galore v0.4.1 or higher (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore)
   
3. cutadapt v1.2.1 or higher (https://github.com/marcelm/cutadapt)
   
4. USEARCH 10.0.240 or higher (http://www.drive5.com/usearch/download.html)
   
5. SGA v0.10.15 or higher (https://github.com/jts/sga)
   
6. Exonerate v2.2.0 or higher (https://www.ebi.ac.uk/about/vertebrate-genomics/software/exonerate)
   
7. Assexon (https://github.com/yhadevol/Assexon)
   
8. Mafft v7.294b or higher (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)
   
9. RAxML (https://github.com/stamatak/standard-RAxML)
   
10. ASTRAL (https://github.com/smirarab/ASTRAL)
    
11. Figtree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)
    

实验步骤