Genome Sequence Capture Based on Pooled PCR-generated Baits

研究背景：

目标序列捕获技术 (Target sequence capture) 用于富集目标基因：通过探针与DNA文库杂交，物理的使感兴趣的目标片段结合到探针上，之后洗去未结合的非目标片段，从而实现对目标基因的富集。目标序列捕获技术经济高效，对DNA的质量要求较低，适用于DNA降解较为严重的样本，近年来已经成为了系统发育学获取数据的主流方法。然而，捕获效率会受到探针与被捕获样本间遗传距离的影响，随着遗传距离增大，捕获效率会逐渐降低，当探针与被捕获样本间的序列相似度小于85%时，捕获将十分困难。因此，使用目标序列捕获技术解析高阶元 (如科间及以上水平) 系统发育关系并不容易。
      目前已经有学者提出多种策略试图解决上述问题，比如：使用高度保守的基因组区域设计探针，如锚定序列捕获 (anchored enrichment, AHE) 和超保守序列元件捕获技术 (ultraconserved element, UCE)，由于目标区域高度保守，探针在远缘类群中也有较高捕获效率，但与此同时，高度保守的目标区域难以为系统发育研究提供充足信号，信号大多来自捕获过程中随机获得的侧翼序列 (flanking sequence)。另一种策略是直接针对保守度较低的外显子区域设计探针，但使用较为宽松的杂交条件，可以在一定程度上提高对远缘类群的捕获效率。最近，又有学者提出了一种新的策略：根据系统发育关系将所研究类群分为多个进化支系，为每一支系设计一套探针，再将多套探针混合起来进行杂交捕获。这种策略能够缩小了探针与被捕获样本间的遗传距离，提高捕获效率。然而，上述所有方法均使用合成探针，需要参考基因组序列用于探针设计，不适用于缺乏基因组资源的非模式生物类群。
      近期有学者提出可以使用PCR产物自制捕获探针，该策略将所研究类群已有的分子标记作为捕获的目标基因，很好的解决了合成探针需要参考基因组资源的难题。并且，该方法获得的数据与PCR扩增子测序得到的数据十分相似，易于与NCBI等公共数据库中的数据进行整合。目前针对不同生物类群的通用分子标记集正不断被开发，例如102个脊椎动物通用核基因分子标记集 (Shen et al., 2013)，96个蛇类通用分子标记集 (Li et al., 2017)，95个甲虫通用核基因分子标记集 (Che et al., 2018)，94个鳞翅目通用核基因分子标记集 (Zhang et al., 2019) 等，这些分子标记资源可以保证在使用PCR产物自制捕获探针时具有充足的目标基因数量。然而，由于该策略只使用单一样本进行PCR扩增，探针与被捕获样本间遗传距离大时捕获效率低的问题仍然存在。
      本方法在使用PCR产物自制捕获探针的基础上，结合前文提到的混合多套探针集的思路，提出了一种新策略，其核心思想是混合来自不同进化支系的代表物种DNA自制PCR产物捕获探针。以往使用单一样本制备探针，捕获效率受限于探针与其最远缘样本间的遗传距离，而混合不同进化支系的代表物种DNA制备探针，相当于为每一进化支系分别制备了一套探针，捕获效率仅受限于一个进化支系内部的遗传距离。因此，即便是高阶元的系统发育学研究，也可以选择较为高变的分子标记，获得更多的信号。我们在鳞翅目中对这一策略进行测试：基于94个鳞翅目通用核基因分子标记集，对来自7个总科，17个科的43种鳞翅目昆虫样本进行杂交捕获，得到了稳健可靠的系统发育关系。样本中绝大多数为干标本，DNA有一定程度的降解，最终所有样本平均94%的目标区域可以被捕获，除此之外，还得到了大量的核编码侧翼序列，使数据集总长远超预期。此外，该策略不仅仅可以应用于高阶元，由于探针制备过程十分灵活，可以根据所研究类群的系统发育关系、物种跨度自由选择代表物种，经测试，种级以上阶元的研究均适用：解析凤蛾科各属之间的系统发育关系的研究结果已发表于Zhang et al., 2020，解析环蛱蝶属属内种间系统发育关系的研究结果已发表于Ma et al., 2020。

材料和试剂

1. 1.5 ml离心管，200 μl离心管，200 μl八联管，96孔板 (BBI Life Sciences)
2. 20 μl，200 μl，1 ml移液枪枪头 (BBI Life Sciences)
3. 琼脂糖 (Life Technologies)
4. 矿物油 (上海生工)
5. TransTaq-T DNA Polymerase (5U) (北京全式金生物)
6. TransTaq-T buffer (10x) (北京全式金生物)
7. dNTPs (10 mM) (上海生工)
8. AMPure XP beads (Beckman Coulter Inc.)
9. 无水乙醇 (分析纯)
10. ATP (100 mM) (上海生工)
11. T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) (Fermentas)
12. T4 Polynucleotide Kinase buffer (10x) (Fermentas)
13. T4 DNA ligase (5 U/μl) (Fermentas)
14. T4 DNA ligase buffer (10x) (Fermentas)
15. PEG-4000 (50%) (上海生工)
16. NaCl (5 M) (分析纯）
17. Tris-HCl, pH 8.0 (1 M) (上海生工)
18. EDTA, pH 8.0 (0.5 M) (上海生工)
19. dsDNA Fragmentase (New England BioLabs Inc. 与超声波DNA打断仪二选一)
20. dsDNA Fragmentase Buffer (10x) (New England BioLabs Inc. 与超声波DNA打断仪二选一)
21. NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit (New England BioLabs Inc.)
22. Human Cot1 (1 µg/µl) (Life Technologies)
23. SSPE (20x) (上海生工)
24. Denhardt’s (50x) (上海生工)
25. SDS (10%) (上海生工)
26. SSC (20x) (上海生工)
27. Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads (Life Technologies)
28. Tween-20 (10%) (上海生工)
29. 通用型DNA纯化回收试剂盒 (天根生化科技 (北京) 有限公司)
30. 0.1x TE缓冲液 (上海生工)
31. 双蒸水 (广州誉维生物科技仪器有限公司Unique超纯水机制)
32. 生物素接头 (见溶液配方)
33. 磁珠结合缓冲液 (见溶液配方)
34. 洗脱缓冲液1 (见溶液配方)
35. 洗脱缓冲液2 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 0.2-2 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1000μl移液枪
2. PCR仪 (96孔，可进行Touch down PCR，博日BIOER TC-E-96G)
3. 涡旋振荡器 (Scientific Industries Vortex-Genie2涡旋振荡器)
4. 适配1.5 ml离心管的磁力架 (推荐16孔，Invitrogen)
5. 适配1.5 ml离心管的震荡孵育器 (杭州奥盛恒温混匀仪MS-100)
6. 适配1.5 ml离心管、200 μl离心管的小型离心机
7. NanoDrop 2000 (Thermo)
8. 电泳仪
9. 服务器 (Linux系统，32G以上的内存，500G的存储)
10. 超声波DNA打断仪 (与DNA片段化酶二选一，宁波新芝SCIENTZ18-A)
    

软件

1. Trimmomatic: http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
2. SPAdes: https://github.com/ablab/spades/
3. CD-HIT: https://github.com/weizhongli/cdhit/
4. BLAST: https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/
5. Exonerate: https://github.com/nathanweeks/exonerate.git
6. Mafft: https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
7. Gblocks: http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks.html
8. RAxML: https://github.com/stamatak/standard-RAxML
   
   
   

图1. 实验步骤与数据分析总流程图

实验步骤