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AFLP基因组捕获技术: 一种通用的低阶元的系统发育分析方法

AFLP Genome Capture Technique: A General Method for Shallow Scale Phylogenetic Analysis

李 李佳璇
梁 梁丹
张 张鹏

发表时间: 2021年02月10日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010598 浏览次数: 3368

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动物系统学与进化研究方法手册
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摘要：AFLP基因组捕获技术是在扩增性片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP) 的实验基础上，将AFLP片段制备成捕获探针，从目标样本的基因组文库中富集特定区域，并进行高通量测序的一种技术。该技术能够在属内种间水平上获取大量的匿名基因序列，或在种下水平上获取大量的SNP位点，以用于系统发育关系重建，群体遗传结构等分析。该技术的主要流程包括: (1) AFLP探针制备；(2)基因组文库构建；(3) 杂交捕获及高通量测序。后续的数据分析流程简单易学，且对计算资源的要求较低，主要为序列组装和提取目标直系同源序列或SNP位点。该技术的优势是: (1) 整个过程不依赖任何参考基因组资源，适合非模式生物的研究；(2) 自制捕获探针，省时，大大降低实验成本；(3) 对目标样本的DNA质量要求较低，高度降解的DNA样本也可被用于分析。

Keywords: 目标序列捕获 search 自制探针 search 系统发育学 search 群体遗传学 search

材料与试剂

  1. 0.2 ml和1.5 ml微量离心管 (BBI Life Sciences，常温储存)
  2. 200 μl八联排管 (BBI Life Sciences，常温储存)
  3. 各种型号的枪头 (10 μl，200 μl，1 ml，BBI Life Sciences，常温储存)
  4. 基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生化科技有限公司，常温储存，catalog number: DP304-03)
  5. 无水乙醇 (分析纯) (广州化学试剂厂，常温储存)
  6. AMPure XP beads (Beckman Coulter，4 °C储存，catalog number: A63881)
  7. Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Life Technologies，4 °C储存，catalog number: 65001)
  8. FastDigest MluI (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: FD0564)
  9. FastDigest SbfI (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: FD1194)
  10. T4 DNA ligase (5 U/μl) (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: EL0014)
  11. Human Cot-1 DNA (1 µg/µl) (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: 15279011)
  12. NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs，-20 °C储存，catalog number: E7645L)
  13. NEBNext dsDNA Fragmentase (New England Biolabs，-20 °C储存，catalog number: M0348L)
  14. TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) (北京全式金生物技术有限公司，-20 °C储存，catalog number: AP131-03)
  15. 100 mM ATP (上海生工生物工程股份有限公司，-20 °C储存，catalog number: A600311)
  16. 10 mM dNTPs (上海生工，-20 °C储存，catalog number: A610056)
  17. 1X TE buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548106)
  18. 20X SSPE buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548111)
  19. 50X Denhardt’s Solution (上海生工，-20 °C储存，catalog number: B548209)
  20. 10 % SDS Solution (上海生工，常温储存，catalog number: B548118)
  21. 20X SSC buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548109)
  22. 5 M NaCl (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548121)
  23. 1 M Tris-HCl Solution，pH 8.0 (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548127)
  24. 0.5 M EDTA，pH8.0 (上海生工，4 °C储存，catalog number: B300599)
  25. 吐温20 (上海生工，常温储存，catalog number: A600560)
  26. 矿物油 (上海生工，常温储存，catalog number: A630217)
  27. 琼脂糖 (Invitrogen，常温储存，catalog number: 75510-019)
  28. 双蒸水 (广州誉维生物科技仪器有限公司Unique超纯水机制)
  29. 吸附缓冲液 (见配方，4 °C储存)
  30. 洗涤缓冲液1 (见配方，4 °C储存)
  31. 洗涤缓冲液2 (见配方，4 °C储存)

仪器设备

  1. 0.5-5 μl，2-20 μl，20-200 μl，100-1000μl移液器 (Thermo Fisher Scientific F2系列)
  2. Gene Pro PCR扩增仪 (杭州博日科技股份技术有限公司，model: TC-E-96G)
  3. Vortex Genie2漩涡混合器 (Scientific Industries，model: G560E)
  4. Cubee迷你离心机 (广州美津生物技术有限公司，model: aqbd-i)
  5. 振荡型恒温金属浴 (杭州奥盛仪器有限公司，model: MS-100)
  6. DynaMag-2 Magnet磁力架 (Thermo Fisher Scientific，model: 12321D)
  7. 超微量分光光度仪 (Thermo Fisher Scientific，model: NanoDrop2000)
  8. 通用电泳仪 (北京百晶生物技术有限公司，model: BC-power6001)
  9. 高压蒸汽灭菌锅 (Kagoshima Seisakusyo Inc.，model: SX-500)
  10. 服务器 (Linux系统，32 G以上的内存，500 G的存储)

软件

  1. Seqtk_demultiplex https://github.com/jameslz/fastx-utils/blob/master/seqtk_demultiplex/
  2. SPAdes https://github.com/ablab/spades/
  3. CD-HIT https://github.com/weizhongli/cdhit/
  4. BLAST 2.6.0 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.6.0/
  5. Python 2.7.9 https://www.python.org/ftp/python/2.7.9/
  6. Biopython 1.68 https://pypi.org/project/biopython/1.68/
  7. PASTA https://github.com/smirarab/pasta
  8. FastTree http://www.microbesonline.org/fasttree/#Install
  9. Phylopypruner https://gitlab.com/fethalen/phylopypruner/-/wikis/Installation
  10. RAxML https://github.com/stamatak/standard-RAxML
  11. ASTRAL 5.7.4 https://github.com/smirarab/ASTRAL

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：李佳璇, 梁丹, 张鹏. (2021). AFLP基因组捕获技术: 一种通用的低阶元的系统发育分析方法. Bio-101: e1010598. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010598.
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How to cite: Li, J. X., Liang, D. and Zhang, P. (2021). AFLP Genome Capture Technique: A General Method for Shallow Scale Phylogenetic Analysis. Bio-101: e1010598. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010598.
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