A Mixed Molecular Marker Amplicon Sequencing Scheme Based on High Throughput Sequencing Platform

摘要：在分子系统学研究中，常常需要测定大量扩增子的序列，以获得分子数据来解析系统发育关系。传统的扩增子测序一般采用Sanger法，但当分子标记和/或样本数量较大时，Sanger法测序成本非常高。本方法是一种基于Illumina HiSeq测序平台，同时测定大量分子标记扩增子的高通量测序方法。实验的主要流程如下：首先将同一样本的不同扩增子进行混合，利用超声波仪器或片段化酶进行打断处理，随后在片段两端连接样本特异性标签，最后将不同样本的标记片段混合并进行文库构建及高通量测序。与Sanger扩增子测序方法相比，本方法的测序成本非常低，测定一个扩增子的成本可以下降至0.1-0.2元。此外，本方法的实验操作流程相较于Sanger测序也更加简便，无需对每个PCR产物进行单独纯化，且对于无可见条带或有非特异性扩增条带的PCR产物可直接混合建库，这大大降低了实验劳动强度。在数据分析方面，本方法提供了简单易学的数据分析流程，且对计算资源要求较低，可概括为三步： (1) 根据样本特异标签对数据进行分选; (2) 使用拼接软件对样本数据进行组装; (3) 使用BLAST比对策略鉴定目标分子标记的序列。综上所述，本方法的实验操作和数据分析流程较为简单，是一种易于掌握的高通量数据技术，适用于大规模测定分子标记扩增子序列的系统发育学研究。

研究背景：近年来，多基因分子标记分析被广泛用于物种间系统发育关系重建。传统方法是利用PCR技术扩增目标分子标记，然后进行Sanger测序，最后通过人工逐一检查测序结果获得最终序列。对于研究物种少 (小于50) 和分子标记数目少 (小于10) 的研究，该方法简单可行，实验劳动强度较小，普通的分子系统学实验室均可开展相关工作。目前，针对不同生物类群的通用基因分子标记工具箱正不断被开发，如102个脊椎动物通用核基因标记 (Shen et al. 2013)，96个蛇类通用基因标记集 (Li et al. 2017)，95个甲虫通用核基因标记集 (Che et al. 2018)，96个鳞翅目通用基因标记集 (Zhang et al. 2019) 等，这为基于多基因分子标记的分子系统学研究提供大量标记资源。然而，当研究物种数目和/或分子标记数目增大时，需要处理成千上万条扩增子，若依然选择Sanger测序法，无论是实验劳动强度还是测序成本都难以承受。随着高通量测序技术的快速发展，高通量测序的成本越来越低，数据分析流程也越来越完善，分子系统学家逐渐开始使用454，Ion Torrent等高通量测序平台对扩增子进行大规模测序。然而这些测序平台的测序通量比较低，测序成本仍然昂贵。为了进一步降低大规模测定扩增子的测序成本，本方法基于一种测序通量更高，测序成本更低的短读长Illumina HiSeq测序平台，提出了一种混合分子标记扩增子高通量测序方法。与Sanger扩增子测序相比，本方法在测序成本和实验劳动强度上有十分明显的优势。例如，一个50 (样本数目) x 100 (分子标记数目) 的分子系统学项目，需要测定5000个扩增子序列，按Sanger双端测序，每个测序反应13元计，测序总费用高达13万元。如果采用Illumina HiSeq测序平台测序，仅需要5-10 Gb测序数据便能满足研究需求，建库测序总费用不超过1000元，每个样本测定一种扩增子的成本不足0.2元，测序成本非常低廉。同时，本方法的实验操作十分简便，不需要像Sanger扩增子测序那样对每个扩增子进行单独纯化，而是直接将同一样本的不同扩增子进行混合， 实验劳动强度小。对于无明显条带或有非特异性扩增的扩增子可直接混合建库，只要测序通量高，也可通过生物信息学分析获得相应序列，然而Sanger扩增子测序却无法做到这一点。此外，本方法还提供了一套完整的数据分析流程，与处理转录组数据较为类似，简单易学，且对计算资源较低。值得一提的是，最终获得的扩增子序列数据也易于与NCBI等公共数据库中的数据相整合。本文提供了详细的混合分子标记扩增子高通量测序方案的实验流程和数据分析流程，有助于传统Sanger测序分子系统学实验室在短时间内掌握。该方案的有效性已在有颌类脊椎动物的分子系统学研究中得以验证，详细结果请参阅Feng et al. 2015.