产品说明书：用于酶促片段化的 KAPA Frag 试剂盒

产品描述

用于酶促片段化的 KAPA Frag 试剂盒可对多种不同类型和起始量（1 ng - 1 μg）的双链 DNA（dsDNA） 进行稳定可重复的酶促片段化，还可以整合入任何需要起始投入片段化 dsDNA 的 NGS 文库构建工作流程中。

该工作流程可实现自动化，与机械性剪切不同，该流程不需要任何专门的设备或耗材。片段化的程度（DNA 片段的主峰大小和大小分布）是由片段化时间和温度来控制的。最佳的片段化参数在某种程度上取决于起始 DNA 的数量和性质，但 KAPA Frag 系统对 DNA 起始量和质量的灵敏度要低很多，因此比其他酶促片段化技术（包括标记）的可重复性更高。

使用 KAPA Frag 系统进行片段化的 DNA 生成的文库，在功能上等同于通过 Covaris 片段化的DNA 制备的文库。

产品应用

KAPA Frag 试剂盒非常适合于对用于NGS 文库构建的 dsDNA 进行低通量和高通量的片段化。它兼容高复杂度的基因组DNA，也兼容低复杂度样本，如小病毒基因组、质粒、cDNA 和长扩增子，以及低质量DNA，如 FFPE 样本片段化DNA 可用于不同的NGS 应用，包括：
● 全基因组鸟枪法测序
●全外显子组测序或靶向测序， 使用 Roche SeqCap EZ、Agilent SureSelect、Illumina TruSeq、IDT xGen Lockdown™探针或其他杂交捕获系统
●长扩增子的测序
●选择的 RNA 测序应用。
KAPA DNA HyperPlus 文库构建试剂盒将结合KAPA Frag 和 KAPA HyperPrep 化学方法，在同一个试管中对您的样本进行片段化/文库构建的操作，可为您提 供 更 高 的 文 库 产 量 。 请 访 问www.sequencing.roche.com 获取更多信息。

片段化实验方法

1. 酶促片段化
   如果DNA 样本含有 EDTA，则使用 KAPA 纯化磁珠进行基于 3X 磁珠的纯化，以在片段化之前去除EDTA。有关详细的DNA 纯化实验方法， 请参阅 KAPA 纯化磁珠（KAPA 纯化磁珠）技术数据表。
   或 者 ， 准 备 足 够 体 积 的 适 当 稀 释 的Conditioning 溶液（每个DNA 样本准备 5 μL， 再加上过量的部分）。有关稀释 Conditioning 溶液的指导，请参阅表 2（第 4 页）。

   1.1

   参照如下方法，稀释用于文库构建的 dsDNA 量：
   ● 如果DNA 制剂不含 EDTA，则在 35 μL 的总体积中用 10 mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）进行稀释
   ● 如果DNA 制剂确实含有 EDTA，则在 30 μL 的总体积中，用含有 EDTA、且样本目前悬浮其中的缓冲液进行稀释。对每一个包含30 μL 含EDTA 的DNA 的反应，加入 5 μL 稀释的 Conditioning 溶液。
   

   1.2

   通过轻轻涡旋或上下移液进行混合

   1.3

   按以下顺序添加剩余组分，在冰上配制每一个片段化反应：
   
   * 可以将 KAPA 片段化缓冲液和酶预先混合，并在反应体系配制之前保存在冰上请注意，酶的体积大于此反应中的缓冲液体积。
   
   

   1.4

   轻轻涡旋并瞬时离心沉降。将 PCR 板/管放回冰上。立即继续下一步。

   1.5

   在 PCR 仪中进行孵育，预冷却至 4 °C，并按下述方法进行程序设置。将盖子的温度设置为 ≤ 50 °C。
   
   
   
   * 这些参数对于高质量基因组DNA 是一个不错的开始。有关如何优化片段化时间和温度的指南，参见反应优 化章节（第 5 页）。如果需要孵育时间的长度超过推荐范围，则样本可能会含有影响片段化效率的抑制剂。 建议在片段化之前进行基于磁珠的 DNA 纯化，而不是增加片段化的时间。
   
   

   1.6

   将反应转移至冰上，并立即添加 5 μL 终止液。轻轻涡旋，并直接进行片段化后纯化（步骤 2） 或片段化后片段选择（步骤 3）。
   
   
2. 片段化后纯化
   2.1

   结合以下方法，进行一次基于磁珠的纯化：
   
   * 标准实验方法适用于 2X 的磁珠与 DNA 比率。有关更多详细信息以及有关如何修改纯化参数的指南，请参阅重要参数（第 3 - 4 页）。
   
   
   2.2

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
   2.3

   将板/管在室温下孵育 5 - 15 分钟以将DNA 结合到磁珠上。
   2.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   2.5

   小心吸出并丢弃上清液。
   2.6

   将板/管置于磁力架上，加入 200 μL 80%乙醇。
   2.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。
   2.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   2.9

   将板/管置于磁力架上，加入 200 μL 80%乙醇。
   2.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育≥30 秒。
   2.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   2.12

   在室温下将磁珠干燥 3-5 分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   2.13

   从磁力架上取下板/管。
   2.14

   将磁珠重悬于适当体积的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 - 8.5）中：
   ●如果加入片段化的起始量在1 - 100 ng 的范围内，则重悬于 10 - 25 μL 的体积中。最小体积取决于所用磁力架的性质。
   ●如果加入片段化的起始量 > 100 ng，则重悬于 30 - 55 μL 的体积中。
   2.15

   通过涡旋和/或上下移液进行彻底混合。
   2.16

   将板/管在室温下孵育 2 分钟以从磁珠上洗脱 DNA。
   2.17

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   2.18

   将澄清的上清液转移到新的 PCR 板/管中。将片段化的文库在 2 ℃至 8 ℃下储存 1-2 周，或在-15 °C 至-25 °C 储存。
   
   
3. 片段化后双侧片段选择
   为了获得片段化 DNA 的较窄片段分布，尤其是当片段化起始量 > 100 ng 时，和/或所需主峰片段长度超过 350 bp 时，在片段化后建议使用任何常用的片段选择技术（例如，此处介绍的双侧片段选择，或电泳法）。
   
   本章节中概述的双侧片段选择实验方法，是设计用于选择范围在 250 - 450 bp 的DNA 片段。为了获得更短或更长的片段，可以按照如下方式修改实验方法：
   
   
   
   * 第二次片段分离应使用至少 0.2 个体积的 AMPure XP。
   
   
   
   请注意，第二次分离所需的 KAPA 纯化磁珠的体积是相对于片段选择过程开始时的 DNA 体积计算得来的，而不是第一次分离后转移的含 DNA 上清液的体积。如果第一次和第二次分离之间的差异小于~0.2 个体积，则 DNA 回收量显著降低。为了增加 DNA 回收量，可以使用> 0.2 体积的 KAPA 纯化磁珠用于第二次分离，但是注意这可能导致文库片段回收偏小和 /或片段大小分布更宽。
   
   有关双侧片段选择的更多信息，请参阅 KAPA NGS 文 库 制 备 技 术 指 南 ， 或 通 过 sequencing.roche.com/support 联系技术支持。
   
   
   3.1

   结合下述方法，进行第一次（0.6X）片段大小分离（以去除大于~450 bp 的片段）：
   
   
   

   3.2

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。

   3.3

   将板/管在室温下孵育 5 - 15 分钟，以将大于~450 bp 的 DNA 片段结合到磁珠上。

   3.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   3.5

   仔细地将含有小于~450 bp 的 DNA 片段的 85 μL 上清液移液到新的板/管中。
   重要的是，不要将磁珠与上清液一起转移。如果板/管中的磁珠结合了大于~450 bp 的DNA 片段，则丢弃这部分板/管。

   3.6

   结合下述方法进行第二次片段分离（0.8X，以保留 > 250 bp 的片段）：
   
   
   

   3.7

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。

   3.8

   将板/管在室温下孵育 5 - 15 分钟，以将大于 ~ 250 bp 的 DNA 片段结合到磁珠上。

   3.9

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   3.10

   仔细地去除并丢弃含有小于~ 250 bp 的 DNA 片段的上清液。

   3.11

   将板/管置于磁力架上，加入 200 μL 80%乙醇。

   3.12

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。

   3.13

   小心吸出并丢弃上清液。

   3.14

   将板/管置于磁力架上，加入 200 μL 80%乙醇。

   3.15

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30 秒。

   3.16

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。

   3.17

   在室温下将磁珠干燥 3-5 分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。

   3.18

   从磁力架上取下板/管。

   3.19

   将磁珠彻底重悬于所需体积的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）。

   3.20

   将板/管在室温下孵育 2 分钟以从磁珠上洗脱DNA。

   3.21

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   3.22

   将进行了片段选择的DNA 转移到新的板/管中， 并将 DNA 在 2 °C 至 8 °C 下保存 1 至 2 周，或保存在-15 °C 至-25 °C。