产品说明书：KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase (HMR) Illumina^® 平台

实验操作流程

1. 试剂准备
   完成该实验方法耗时约6.5小时。理想情况下，应根据需要准备流程中不同步骤的反应预混液。
   
   为获得最高的稳定性和最长的保质期，含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒中的酶和反应缓冲液应单独提供。对于精简的实验方法，每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂反应预混液，如表1-表7中所示。表8列出了含有RiboErase (HMR) 的KAPA RNA HyperPrep试剂盒实验方法中所需的其他试剂的量。
   
   需始终确保KAPA纯化磁珠和PEG/NaCl溶液在使用前已彻底平衡至室温。
   
   表1. 寡核苷酸杂交
   
   
   表2. rRNA去除
   
   
   表3. DNA酶消化
   
   
   表4. 第一条链合成
   
   
   表5. 第二条链合成与加A尾
   
   
   表6. 接头连接
   
   
   表7. 文库扩增
   
   
   表8. 所需其他试剂的量
   
   
   
   
   
2. 寡核苷酸杂交和rRNA去除
   该实验方法是在10 μL不含RNA酶的水中，需要总量为25 ng-1 μg的RNA。
   确保在使用前已准备好了杂交反应预混液 (表1)和去除反应预混液 (表2)，并在室温下储存。
   
   
   2.1

   按如下方式设置热循环仪的程序：
   
   
   
   2.2

   按下述方式配制rRNA杂交反应：
   
   
   
   2.3

   将样本置于预编程的热循环仪中，并执行程序。
   2.4

   确保添加了含有RNA酶H的去除反应预混液，同时样本在热循环仪中于45 °C下保存。当程序在45 °C下到达暂停步骤时，在每个20 μL杂交反应中添加以下物质并通过多次上下吹打彻底混合。
   
   
   
   2.5

   恢复循环程序，继续进行去除步骤 (45 °C，持续30分钟)。
   2.6

   立即进行rRNA去除纯化 (步骤3)。
   
   
3. rRNA去除纯化
   3.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   3.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   3.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   3.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.5

   小心吸出并丢弃75 μL的上清液。
   3.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   3.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   3.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   3.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   3.12

   在室温下将磁珠干燥3 - 5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
4. DNA酶消化
   为了从已去除核糖体的RNA中去除杂交寡核苷酸，将样本与DNA酶一起孵育。确保已制备了DNA酶消化反应预混液 (表3)，并保存在室温。
   
   
   4.1

   按下述方式配制DNA酶消化反应：
   
   
   
   4.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   4.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。
   4.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   4.5

   仔细将20 μL的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   4.6

   采用如下实验方法孵育带有上清液的板/管：
   
   
   
   4.7

   立即进行DNA酶消化纯化(步骤5)。
   
   
5. DNA酶消化纯化
   5.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   5.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   5.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   5.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.5

   小心吸出并丢弃60 μL的上清液。
   5.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   5.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   5.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   5.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   5.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
6. RNA洗脱、片段化和引发
   在片段化、引发和洗脱缓冲液 (1X中，将去除rRNA的RNA从磁珠上洗脱，并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。
   
   
   6.1

   结合如下方法在室温下制备所需量的片段化、引发和洗脱缓冲液(1X)：
   
   
   
   6.2

   通过多次上下移液，在22 μL的片段化、引发和洗脱缓冲液(1X)中，彻底重悬磁珠，这些带有经过纯化和DNA酶处理的RNA。
   6.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。
   6.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   6.5

   仔细将20 μL的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   安全停止点
   样本可以在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 24小时。准备好后，继续执行步骤6.6。
   6.6

   将板/管置于热循环仪中，并按照如下方法进行片段化和引发程序：
   
   
   
   6.7

   将板/管置于冰上，立即继续进行第一条链合成(步骤7)。
   
   
7. 第一条链合成
   7.1

   在冰上，按照如下所述配制第一条链合成反应：
   
   
   
   7.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混合。
   7.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   
   7.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行第二条链合成与加A尾 (步骤8)。
   
   
8. 第二条合成与加A尾
   8.1

   在冰上，按照如下所述配制第二条链合成与加A尾反应：
   
   
   8.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混合。
   8.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   8.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行接头连接 (步骤9)。
   
   
9. 接头连接
   9.1

   洗脱接头准备连接，目的是获得以下浓度：
   
   
   
   9.2

   在冰上，按照下述方式设置接头连接反应：
   
   
   
   9.3

   将板/管保存在冰上，通过多次上下移液进行彻底混合。
   9.4

   将板/管在20 °C下孵育15分钟。
   9.5

   立即进行第一次连接后纯化 (步骤10)。
   
   
10. 第一次连接后纯化
    10.1

    结合以下方法，进行一次0.63X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    10.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    10.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    10.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    10.5

    小心吸出并丢弃175 μL的上清液。
    10.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    10.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    10.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    10.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    10.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育≥30秒。
    10.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    10.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    10.13

    从磁力架上取下板/管。
    10.14

    在50 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中彻底重悬磁珠。
    10.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    安全停止点
    含有重悬磁珠的溶液可在2 °C至8 °C储存 ≤ 24小时。不要冰冻磁珠，因为这会导致DNA大量丢失。准备好后，进行第二次连接后纯化 (步骤11)。
    
    
11. 第二次连接后纯化
    11.1

    结合以下方法，进行一次0.7X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    11.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    11.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    11.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.5

    小心吸出并丢弃80 μL的上清液。
    11.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    11.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    11.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    11.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    11.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    11.13

    从磁力架上取下板/管。
    11.14

    在22 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 中彻底重悬磁珠。
    11.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    11.16

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.17

    将20 μL澄清的上清液移液到新的平板/管中，并进行文库扩增(步骤12)。
    安全停止点
    纯化的接头连接文库DNA可以在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或冰冻在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 1个月。准备好后，继续进行文库扩增(步骤12)。
    
    
12. 文库扩增
    12.1

    按如下方式配制每个文库扩增反应：
    
    
    
    12.2

    通过多次上下吹打进行充分混合。
    12.3

    使用以下热循环序列扩增文库：
    
    *非标准(即除外Illumina TruSeq^®)接头/引物组合可能需要对退火温度进行优化。
    
    
    12.4

    进行文库扩增纯化(步骤13)。
    
    
13. 文库扩增纯化
    13.1

    结合以下方法，进行一次1X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    13.2

    通过涡旋和/或多次上下吹打进行彻底混合。
    13.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    13.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.5

    小心吸出并丢弃95 μL的上清液。
    13.6

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    13.7

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.8

    小心吸出并丢弃上清液。
    13.9

    将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
    13.10

    在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.11

    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    13.12

    在室温下将磁珠干燥3 - 5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    13.13

    在22 μL 10 mM的Tris-HCl (pH 8.0-8.5)中彻底重悬已干燥的磁珠。
    13.14

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    13.15

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.16

    将20 μL澄清的上清液转移到一个新的板/管中，并将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或在 -15 °C至 -25 °C下储存。
    
    

使用过本产品的部分文献

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