罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部

doi:10.21769/BioProtoc.1010522

Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

产品说明书：KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒

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发表时间: 2019年08月15日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010522 浏览次数: 4442

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适用说明：本说明书适用于KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒（07962380001, 07962401001和07962428001）和用于无PCR扩增流程的KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒（07962398001, 07962410001和07962436001）。

友情提示：
1)本文档中的页码，附录均指原说明书中的页码及附录；
2)本文档包含原说明书中的产品描述，产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息，欲了解关于本产品详细说明及信息，建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载）。

产品描述

KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒提供了DNA片段化和文库构建一体化的解决方案，能够方便、快速用于Illumina测序文库的构建。本试剂盒采用的新型单管化学法和实验流程提高了文库构建的效率和一致性。与采用Covaris剪切片段化DNA的KAPA HyperPrep文库构建试剂盒相比，其产生的文库质量相当甚至更好。而在稳定性、灵活性、序列覆盖率以及均一性方面，均优于基于转座酶标记的工作流程。该工作流程结合了酶促步骤，并采用最少的基于磁珠的纯化步骤，从而将样本处理和整个文库制备时间缩短至1.5-3小时。本试剂盒中包含以下操作所需的所有酶和反应缓冲液：

酶促片段化以产生dsDNA片段；
末端修复和加A尾，可产生末端修复并5'-磷酸化、3'-dA加尾的dsDNA片段；
接头连接，这期间具有3'-dTMP端的dsDNA接头与3'-dA加尾的分子连接；
文库扩增（可选），采用高保真、低偏差PCR扩增两端携带适当接头序列的文库片段。

该试剂盒各提供一管浓缩缓冲液和一管酶混合物，用于酶促片段化另两个文库构建步骤，但不包括接头和文库扩增后用于纯化的磁珠。KAPA纯化磁珠和KAPA接头是单独出售的。

为了使序列覆盖均一性达到最大化，将文库扩增偏差控制到最小是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是专为低偏差、高保真度PCR设计的，也是NGS文库扩增的首选试剂^{1, 2, 3, 4}。 KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒包括KAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X），是一种随时可使用的包含了文库扩增所有组分的PCR混合物（不包括引物和模板）。试剂盒还包括了文库扩增混合引物（10X）以用于两侧含有P5和P7流动槽序列的Illumina文库的高效扩增。没有扩增模块（KK8501, KK8503和KK8505）的试剂盒可用于无PCR扩增流程。它们还可以与KAPA HiFi实时文库扩增试剂盒（KK2701，KK2702）结合使用，以更精确地控制文库扩增。

Oyola, S.O., et al., BMC Genomics 13, 1 (2012).
Quail, M.A., et al., Nature Methods 9, 10 (2012).
Quail, M.A., et al., BMC Genomics 13, 341 (2012).
Ross, M.G., et al., Genome Biology 14, R51 (2013).

产品应用

KAPA DNA HyperPlus文库构建试剂盒非常适用于低通量和高通量NGS文库构建工作流程，这些工作流程需要进行DNA片段化、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增（可选）。该试剂盒可用于不同起始类型DNA（1 ng-1 μg）样本的文库构建，并与复杂的基因组DNA、低复杂度样本（如小病毒基因组、质粒、cDNA和长的扩增子）和低质量DNA（如FFPE样本）兼容。
整个工作流程是自动化友好的，可以整合到一系列NGS应用的工作流中，包括：
● 全基因组，鸟枪测序
● 使用Roche SeqCap EZ、Agilent SureSelect、Illumina TruSeq或IDT xGen Lockdown探针，或其他杂交捕获系统的全外显子组或靶向测序。
● RNA-seq（从cDNA开始）。

工作流程图

实验操作流程

注意：
●首次使用者应参阅附录2：在尝试使用该试剂盒之前需要优化片段化参数（第16页），这是因为通过您的特定DNA样本制备文库时，采用标准片段化参数可能不会获得最佳的片段大小分布。评价该试剂盒时，不应使用珍贵的样本。相反，而应使用量大非珍贵DNA样本来优化参数，选择的样本要能够代表待处理的实际样本。
●如果您的DNA样本含有EDTA，请参阅附录2：包含处理含有EDTA的DNA样本（第16页）以及重要参数：在开始进行实验方法之前的起始DNA（第4页）。
●该实验方法不包括片段选择。有关详细的连接后或扩增后进行双侧片段选择的实验方法，（请参阅附录1第15页）。

酶促片段化
如果DNA样本含有EDTA，则使用KAPA纯化磁珠进行基于3X磁珠的纯化，以在片段化之前去除EDTA。有关详细的DNA纯化实验方法，请参阅KAPA纯化磁珠（KAPA纯化磁珠）技术数据表。或者，准备足够体积的适当稀释的调节溶液（每个DNA样本准备5 μl，再加上过量的部分）。有关稀释调节溶液的指导，请参阅表1。

表1. DNA起始量范围的预期转化率

1.1
参照如下方法，稀释用于文库构建的dsDNA量：
● 如果DNA制剂不含EDTA，则用10 mM Tris-HCl（pH 8.0-8.5）稀释至35 μl的总体积。
● 如果DNA制剂确实含有EDTA，则在DNA样本中加入DNA洗脱缓冲液/重悬缓冲液至30 μl，而后加入5 μl稀释的调节溶液。
1.2
通过轻轻涡旋或上下移液进行混合。
1.3
按以下顺序添加组分，在冰上组装每一个片段化反应：

*可以将KAPA片段化缓冲液和酶预混合，并在反应设置之前冰上保存，并作为单一溶液进行分配。请注意，缓冲液的体积小于该反应中酶的体积。

1.4
轻轻涡旋并短暂离心沉降。将PCR板/管放回冰上。立即继续下一步。
1.5
在PCR仪中进行孵育，预冷却至4 °C，并按下述方法进行程序设置，这一步骤不需要加热盖。如果使用加热盖，将其温度设置为 ≤ 50 °C。

*这些参数对于高质量基因组DNA是一个不错的开始。请参阅附录2：指南中“优化片段化参数”（第16页）是指如何优化片段化时间和温度。如果需要孵育时间超过推荐范围，则样本可能会含有影响片段化效率的抑制剂。建议在片段化之前进行基于磁珠的DNA纯化，而不是增加片段化的时间。

1.6
将反应转移到冰上，并立即进行末端修复和加A尾（步骤2）。
末端修复和加A尾
2.1
在进行酶促片段化的相同板/管中，按照如下方法配制每个末端修复和加A尾反应：

*最好将缓冲液和酶混合物进行预混合，并在单次移液步骤中加入。预混合物在室温下可保持 ≤ 24小时，在2 °C至8 °C下可保持 ≤ 3天，在-15 °C至-25 °C下可保持 ≤ 4周。

2.2
轻轻涡旋并短暂离心沉降。将反应板/管放回冰上。立即继续下一步。

*片段化酶和末端修复酶均在65 °C下失活。当根据建议设置反应时，额外的片段化应该可以忽略不计。对于酶促片段化DNA，末端修复的短暂时间是足够的。 **如果无延迟地顺利进行接头连接反应设置，可将反应冷却至20 °C而不是4 °C。

2.3
在PCR仪中进行孵育，采用下述方法设置程序。这一步骤需要使用加热盖。如果可能，将加热盖的温度设置为~ 85 °C（而不是常用的~ 105 °C）。
2.4
立即继续进行接头连接（步骤3）。
接头连接
3.1
将接头原液稀释至适当的浓度，如下表2所示：

表2. 通过1 ng – 1 μg起始DNA*进行文库构建的推荐接头浓度

*接头：插入片段摩尔比的计算是基于DNA片段长度为200 bp，对于更长的DNA片段摩尔比会更高，对于片段大小< 200bp的DNA摩尔比会略低。对于> 100 ng的起始DNA推荐用较低浓度的接头：插入片段摩尔比，这意味着文库构建效率和成本之间的取舍平衡；如果使用更高的接头浓度，将获得更高的文库产量。

3.2
在进行末端修复和加A尾的相同PCR板/管中，按如下方式组装每个接头连接反应：

*最好将水、缓冲液和连接酶进行预混合，并在单次移液步骤中加入。预混合物在室温下可保持 ≤ 24小时，在2 °C至8 °C下可保持 ≤ 3天，在-15 °C至-25 °C下可保持 ≤ 4周。

3.3
充分混合并短暂离心。
3.4
在20 °C孵育15分钟。
注意：如果要获得更高的转化率和文库产量，特别是对于低起始量样本，可以考虑增加连接时间， 20 °C条件下不超过 4小时，或者在2-8 °C条件下，可反应过夜。请注意，更长的连接时间可能会导致接头二聚体产生的比例明显升高。当连接时间显著增加时，则必须优化接头浓度。
3.5
立即进行连接后纯化（步骤4）。
连接后纯化
4.1
在相同的PCR板/管中，通过结合以下方式，进行0.8X基于磁珠的纯化：

4.2
通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
4.3
将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
4.4
将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
4.5
小心吸出并丢弃吸去上清液。
4.6
将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
4.7
在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
4.8
小心吸出并丢弃吸去上清液。
4.9
将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
4.10
在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
4.11
小心吸出并丢弃吸去上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
4.12
在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
4.13
从磁力架上取下板/管。
4.14
重悬磁珠：
●用25 μl洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）后续进行文库扩增（步骤5），或
●用55 μl洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）后续进行双侧片段选择（参阅原说明书附录1）。
4.15
将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
4.16
将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
4.17
将澄清的上清液转移到新的PCR板/管中：
文库扩增
注意：请参阅重要参数：文库扩增（第7页）和KAPA NGS文库制备技术指南，了解有关优化文库扩增的更多信息。
5.1
按如下方式组装每个文库扩增反应：

*或者其他合适的10X文库扩增引物混合物。文库扩增反应中每种引物的推荐终浓度为0.5-4 μM。另请参阅重要参数：文库扩增（第7页）。

5.2
充分混合并短暂离心。
5.3
使用以下PCR条件进行扩增：

*非标准（即除外Illumina TruSeq）接头/引物组合可能需要优化退火温度。

表3. 从1 ng–1 μg起始DNA中产生100 ng或1μg扩增DNA的推荐循环数

*无论连接后是否有足够量的文库，当使用不完整的接头时，至少需要少量的扩增周期（1-3）来完成接头序列，以用于流程的下一步骤（靶向捕获或测序）。所需的循环次数取决于特定的接头和扩增引物设计。

表4. 从500 pg-500 ng接头连接文库DNA*中获得约1 μg扩增文库DNA所需的理论循环数

*本表中推荐的理论循环数适用于使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix和文库扩增引物扩增的文库，且文库定量使用的是基于实时定量PCR的KAPA文库定量试剂盒。

5.4
直接进行扩增后纯化（步骤6）。
扩增后纯化
6.1
通过结合以下方式，在文库扩增板/管中执行1X基于磁珠的纯化：

6.2
通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
6.3
将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
6.4
将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
6.5
小心吸出并丢弃去上清液。
6.6
将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
6.7
在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
6.8
小心吸出并丢弃去上清液。
6.9
将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
6.10
在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
6.11
小心吸出并丢弃去上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
6.12
在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
6.13
从磁力架上取下板/管。
6.14
将磁珠彻底重悬于适当体积的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）或PCR级水中。如果进行靶向捕获，始终使用PCR级水。
注意：如果进行第二次扩增后纯化，或双侧片段选择（附录1），需要将磁珠重悬于55 μl洗脱缓冲液中。
6.15
将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
6.16
将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
6.17
将澄清的上清液转移到新的平板/管中，并根据需要进行片段选择（参见附录1）、文库QC、靶向捕获或测序。将纯化的扩增的文库在 2 °C至8 °C储存1-2周，或在-15 °C至-25 °C储存。