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特异性B细胞免疫反应的流式检测

The Detection of Specific B Cell Immune Response by Flow Cytometry

刘 刘懿蕃
华 华兆琳
侯 侯百东

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010344 浏览次数: 7626

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流式细胞术实验手册
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摘要：B 细胞主要通过呈递抗原和产生抗体在自身免疫病的发生、发展中发挥重要作用，研究抗原特异性的B细胞免疫反应非常重要，但是对于特异性B细胞免疫反应的检测非常困难，于是我们根据B细胞上的BCR可以识别Qb抗原的特性，利用Qb-AF647富集到抗原特异性B细胞。由于流式细胞仪是使细胞以单个方式依次通过探测光束，并采集细胞被光照时产生的各种信号，并能对多个荧光参数进行关联分析的一种仪器，所以我们对富集后的抗原特异性B细胞通过流式细胞仪进行检测。

Keywords: B细胞 search 流式细胞染色 search 流式细胞仪 search


材料与试剂

  1. 5 ml 流式管
  2. 枪尖若干：2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml
  3. 40 μm和70 μm过滤筛
  4. U型底96孔板
  5. 六孔板
  6. 15 ml、50 ml离心管
  7. 1 ml带针注射器
  8. 可放置5 ml流式管的试管架2~3个
  9. 解剖工具和烧杯
  10. Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads (Miltenyi, catalog number: 130-091-395)
  11. LS Separation columns (Miltenyi, catalog number: 130-042-401)
  12. 小鼠 (C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周以上，数量根据实验需求安排)
  13. DNase I 10 mg/ml (Worthington, catalog number: LS002140，溶剂为20 mM Tris，1 mM MgCl2，PH7.5)
  14. Collagenase 4,000 U/mg (Worthington, catalog number: LS004177，溶剂为PBS)
  15. Qb-AF647 (荧光蛋白) [Qb为实验室自行表达纯化，用AF647标记试剂盒 (Invitrogen, catalog number: A20173) 标记Qb，合成Qb-AF647]
  16. Anti-CD16/32抗体 (Bioxcell, catalog number: BE0307)
  17. 大鼠血清
  18. 流式抗体 (表1)

    表1. 流式抗体详细信息


  19. PBS溶液和蒸馏水 (0.22 µm滤膜过滤)
  20. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
  21. HEPES 25 mM PH 7.4 (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375，溶剂为ddH2O)
  22. FCS
  23. EDTA
  24. NaN3
  25. Tris
  26. MgCl2
  27. NaOH
  28. 消化液 (见溶液配方)
  29. FC block (见溶液配方)
  30. FACS 缓冲液 (见溶液配方)
  31. 0.5 M EDTA (见溶液配方)

仪器设备

  1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
  2. 12通道200 µl排枪
  3. 磁力架 (Miltenyi)
  4. 台式冷冻离心机 (Thermo, model: LEGEND RT+)
  5. 恒温培养箱 
  6. 旋转仪
  7. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, model: Coulter Z2)
  8. 旋涡混匀器 (配抗体mix)
  9. 水浴锅
  10. 高压蒸汽灭菌锅
  11. BD FACS 流式细胞仪 (BD, model: BD LSRFortessa)，配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表2)

    表2. 流式细胞仪激光器配置信息

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：刘懿蕃, 华兆琳, 侯百东. (2019). 特异性B细胞免疫反应的流式检测. Bio-101: e1010344. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010344.
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How to cite: Liu, Y. F., Hua, Z. L. and Hou, B. D. (2019). The Detection of Specific B Cell Immune Response by Flow Cytometry. Bio-101: e1010344. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010344.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分化 > B 细胞

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