The Detection of B Cell Antibody Isotype by Flow cytometry

材料与试剂

1. 5 ml 流式管
2. 枪尖若干：2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml
3. 40 μm和70 μm过滤筛
4. U型底96孔板
5. 六孔板
6. 15 ml、50 ml离心管
7. 1 ml带针注射器
8. 解剖工具和烧杯
9. 可放置5 ml流式管的试管架 2~3 个
10. Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads (Miltenyi, catalog number: 130-091-395)
11. LS Separation columns (Miltenyi, catalog number: 130-042-401)
12. 小鼠 (C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周以上，数量根据实验需求安排)
13. 大鼠血清
14. Anti-CD16/32抗体
15. DNase I 10 mg/ml (Worthington，catalog number: LS002140，溶剂为20 mM Tris，1 mM MgCl2，PH 7.5)
16. Collagenase 4,000 U/mg (Worthington，catalog number: LS004177，溶剂为PBS)
17. Qb-AF647 (荧光蛋白) (Qb为实验室自行表达纯化，用AF647标记试剂盒 (Invitrogen, catalog number: A20173) 标记Qb，合成Qb-AF647)
18. FCS
    
19. 流式抗体 (表1)
    
    表1. 流式抗体详细信息
    
    
    
20. PBS 溶液和蒸馏水 (0.22 µm 滤膜过滤)
21. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
22. HEPES (25 mM, PH 7.4) (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375，溶剂为ddH2O)
23. EDTA·2H₂O
24. NaN₃
25. Tris
26. MgCl₂
27. NaOH
28. BD Cytofix/Cytoperm缓冲液
29. BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液
30. 消化液 (见溶液配方)
31. FC block (见溶液配方)
32. FACS缓冲液 (见溶液配方)
33. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
2. 12通道200 µl排枪
3. 磁力架 (Miltenyi)
4. 水浴锅
5. 台式冷冻离心机 (Thermo, model: LEGEND RT+)
6. 恒温培养箱 
7. 旋转仪
8. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, model: Coulter Z2)
9. 旋涡混匀器 (配抗体mix)
10. BD FACS 流式细胞仪 (BD, model: BD LSRFortessa)，配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表2)
    
    表2. 流式细胞仪激光器配置信息
    
    

实验步骤