研究背景：机体内常有一些受刺激或感染而产生的异常细胞，如肿瘤细胞、受感染的细胞。而固有免疫和适应性免疫能先后识别并清除这些异常细胞。其中NK细胞在固有免疫中发挥重要的作用。NK细胞可以迅速识别并杀伤非己或异常的细胞，其杀伤机制主要分为直接和间接的方式。直接杀伤包括Fas/FasL途径和TRAIL/DR5途径，而间接的杀伤方式包括分泌IFN-γ和颗粒酶、穿孔素等。NK细胞不同于T、B细胞，不表达TCR、BCR，但其胞质内富含嗜天青颗粒，激活后颗粒明显增多，这些颗粒与其杀伤活性有关，所以NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。
        由于IFN-γ在胞内内质网合成、高尔基体加工后向外分泌，这将影响IFN-γ胞内染色检测的准确性，所以在共孵育1小时后需加入Brefeldin A和Monensin封闭高尔基体。孵育一段时间后，进行染色，即可流式检测。NK细胞中的细胞毒性颗粒主要存在于分泌性溶酶体，而CD107a又称溶酶体相关膜蛋白-1，是存在于溶酶体膜上的一种蛋白，当分泌性溶酶体分泌的过程中，溶酶体与细胞膜结合，CD107a随溶酶体膜与细胞膜结合而表达在细胞膜上，所以CD107a的表达程度与细胞脱颗粒程度正相关。
        相比于其他测细胞毒活性的方法，51Cr释放实验虽然之前很长一段时间内是检测细胞毒活性的黄金标准，但51Cr具有半衰期短、放射性等缺点，而LDH释放法具有敏感性低的缺点。而本实验具有安全、便捷、特异等特点，便于研究各基因、蛋白等对NK细胞细胞毒性的影响，发掘其中的机制。

材料与试剂

1. 镊子
2. 剪刀
3. 24孔板 (Costar) 
4. 60 mm x 15 mm平皿 (Corning, catalog number: 430166) 
5. 15毫升离心管 (BD Falcon, catalog number: 352096) 
6. 100目滤网
7. 注射器活塞
8. 血球计数板
9. 小鼠
10. 胎牛血清
11. CD107抗体 (eBioscience，catalog number: 50-1071, clone eBio1D4B, 1:100)
12. IFNγ抗体 (eBioscience, catalog number: 50-1071, clone XMG1.2, 1:200)
13. Poly I:C (InvivoGen, catalog number: 31852-29-6) 
14. PMA (Sigma-Aldrich, catalog number: P1585) 
15. Inomycin (Sigma-Aldrich, catalog number:407951) 
16. 红细胞裂解液 (eBioscience, catalog number: 00-4333-57) 
17. Brefeldin A Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4506-51) 
18. Monensin Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4505-51) 
19. PBS
20. PFA
21. 1640培养基 (WISENT, catalog number: 350-006-CL) 
22. 皂素 (Saponin, Sigma-Aldrich, catalog number: 47036) 
23. 洗液 (见溶液配方)
24. 细胞穿膜固定液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 二氧化碳培养箱
2. 多色流式细胞仪
3. 超净工作台
4. 离心机
   

实验步骤