Fluorescence Activated Cell Sorting of Yeast Cells Using Flow Cytometry

研究背景：本文的酵母展示文库是一个合成库 (非免疫库)，可针对任何靶蛋白进行筛选(Cherf和Cochran，2015；McMahon等，2018)，其设计如图1所示。首先，所有的纳米抗体的C端融合了一个HA标签，在与荧光标记的HA抗体孵育的情况下，可用于检测酵母细胞中纳米抗体的表达情况。而HA标签C端则融合一个长铰链区连接到酵母细胞表面实现有效的展示(McMahon等，2018)。其次，展示库中含有约5 × 10⁸种纳米抗体序列，其区别在于3个可变区的氨基酸序列(McMahon等，2018)。在实际操作中，因为文库数量巨大，一般先采用磁珠分选的方法对能结合靶蛋白的酵母进行富集，然后再采用更精确的荧光流式分选进行进一步富集(Schutz等，2016；McMahon等，2018)。流式荧光分选时，荧光信号一般来自于靶蛋白质上的化学标记，如对赖氨酸进行特异标记的带有N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰的Alexa Fluor 647或fluorescein isothiocyanate (FITC) 等染料。为了方便描述，本文采用GFP作为靶蛋白，省略了荧光标记步骤。


图 1. 纳米抗体展示库示意图. 纳米抗体的C端融合了一个HA标签，再通过一个铰链区结合到酵母细胞壁上实现展示 (McMahon等，2018)。

材料与试剂

1. 孔径为0.22 μm的滤膜 (Tansoole, catalog number: 02026463)
2. 孔径为40 μm的滤网 (Falcon, catalog number: 352340 )
3. 底部透明的96孔板 (Nunc, catalog number: 8494)
4. 细胞培养板24孔 (洁特，catalog number: TCP000024(EFU225))
5. HA小鼠源抗体 (Sigma-Aldrich, catalog number: H3663-200 μl)
6. Cy3标记的山羊抗小鼠二抗 (Jackson, catalog number: 115-165-166)
7. 牛血清白蛋白 (Aladdin, catalog number: A104912-100G)
8. 纳米抗体酵母表面展示库 (哈佛大学Andrew Kruse教授组构建)
9. 色氨酸缺陷的氨基酸混合物 (Sigma-Aldrich, catalog number: Y1876)
10. 酵母基础氮源 (BD, catalog number: 291930-10 KG)
11. 柠檬酸钠 (Aladdin, catalog number: S116315-1KG)
12. 柠檬酸 (Sigma-Aldrich, catalog number: C2404-500G)
13. 葡萄糖 (国药，catalog number: 14431-43-7)
14. 链霉素青霉素 (美仑生物，catalog number: MA0110)
15. 半乳糖 (Ameresco, catalog number: 0637-500G)
16. HEPES (Ameresco, catalog number: 0511-1KG)
17. 氯化钠 (Ameresco, catalog number: 0241-10KG)
18. 麦芽糖 (Sigma-Aldrich, catalog number: M5885-100G)
19. 琼脂粉 (国药，catalog number: 10000561)
20. 氢氧化钠
21. Yglc4.5-Trp培养基 (见溶液配方)
22. Ygal4.5-Trp培养基 (见溶液配方)
23. Yglc4.5-Trp平板 (见溶液配方)
24. 缓冲液A (见溶液配方)
25. HEPES/Na (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 摇床 (知楚，model: ZQZY-C)
2. 酶标仪 (Spectra Max, model: M2)
3. 旋转培养器 (Kylin-Bell lab instruments, model: QB-128)
4. 离心机 (Eppendorf, model: 5424R)
5. 流式细胞仪 (BD, model: LSRFortessa; Beckman, model: Beckman Coulter Moflo-XDP)
6. 超低温冰箱 (Eppendorf, model: CryoCube F570)
7. 水浴锅 (精宏，model: XMTD-8222 )
8. 培养箱 (上海博迅，model: SPX-100B-Z)
9. 高压灭菌锅
   

实验步骤