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肠道固有淋巴样细胞亚群分类及表型检测

Classification and Phenotype Analysis of Mouse Intestinal Innate Lymphoid Cells (ILCs)

章 章晶晶
沈 沈蕾

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327 浏览次数: 13555

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流式细胞术实验手册
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摘要：固有淋巴样细胞是近年来新发现的一群缺乏T、B细胞抗原特异性受体的天然免疫细胞亚群，主要分布在器官和黏膜组织，对维持组织免疫稳态具有重要调节作用，而其功能异常可导致组织炎症性疾病如炎症性肠病和哮喘等疾病的发生。目前关于这类细胞的发育调控、组织特异性、以及细胞命运的可塑性等方面还没有完全研究清楚，因此本实验基于肠道富含各种固有淋巴样细胞亚群，拟通过多色流式染色技术，建立分析肠道固有层固有淋巴样细胞三个亚群组成及深度解析细胞表型的方法。

Keywords: 固有淋巴样细胞 search 表型检测 search 多色流式染色分析技术 search

材料与试剂

材料：

  1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: 430791)
  2. 5 ml离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
  3. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
  4. 6 孔板 (Corning, catalog number: 3516)
  5. 10 cm培养皿 (上海雷布斯，catalog number: 350003)
  6. 眼用手术剪 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYY1030)
  7. 眼用镊 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1030)
  8. 70 μm滤膜 (Corning, catalog number: 352350)
  9. 0.22 μm过滤器
  10. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
  11. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
  12. 3 ml圆头吸管 (Biologix，30-0138A1)
  13. 96孔圆底板 (Corning, catalog number: 3360)
  14. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)

试剂：
  1. Dnase I (Sigma-Aidrich，DN25-1G，配成150 mg/ml的母液-80 °C保存)
  2. Type VIII Collagenase (Sigma-Aidrich，C2139-1G，配成100 KU/ml的母液-80 °C保存)
  3. Lonsera乌拉圭 (南美) 特级胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
  4. 20x PBS缓冲液 (生工，catalog number: B548117)
  5. 无水酒精 (常熟市鸿盛精细化工有限公司，catalog number: 64-17-5)
  6. 0.5 M EDTA (生工，catalog number: B300599)
  7. 二硫苏糖醇DTT (Sigma-Aldrich，catalog number: D9779-1G，配成1M母液-80 °C保存)
  8. RPMI 1640培养基 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
  9. Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) 双抗 (P/S, Gibco, catalog number: 15140-122) 
  10. Percoll (GE Healthcare, catalog number: 17-0891-09)
  11. eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscienceTM, catalog number: 00-5523-00)
  12. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
  13. 丙三醇
  14.  Permeabilization Buffer
  15. Fixation/Permeabilization Concentrate
  16. Fixation/Permeabilization Diluent
  17. 1x PBS (见溶液配方)
  18. 75%酒精 (见溶液配方)
  19. 洗液1 (见溶液配方)
  20. 洗液2 (见溶液配方)
  21. 消化液 (见溶液配方)
  22. 1640完全培养基 (见溶液配方)
  23. DNase I母液 (见溶液配方)
  24. Collagenase VIII胶原酶母液 (见溶液配方)
  25. 40% Percoll (见溶液配方)
  26. 80% Percoll (见溶液配方)
  27. 细胞活力染料溶液 (见溶液配方) 
  28. FACS buffer (见溶液配方)
  29. Block溶液 (见溶液配方)
  30. 抗体混合物溶液 (见溶液配方)
  31. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)
  32. 1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)

抗体：
  1. TruStainfcXTM (anti-mouse CD16/32) (Biolegend, catalog number: 101320)
  2. Fixable Viability Stain620 (PE-CF594) (BDBiosciences, catalog number: 564996)
  3. Hamster Anti-Mouse CD3-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562286)
  4. Rat anti-mouse B220-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562290)
  5. Rat anti-mouseGr1-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562710)
  6. Rat anti-mouseCD11b-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562287)
  7. Hamster anti-mouseCD11c-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562454)
  8. MouseantimouseCD45.2-AlexFluor 700 (BDBiosciences, catalog number: 560693)
  9. PE/Cy7 anti-mouse CD90.2 Antibody (Biolegend, catalog number: 105325)
  10. Rat antimouseCD127-PE-Cy5 (eBioscience, catalog number: 15-1271-82)
  11. APC anti-mouseCD25antibody (Biolegend, catalog number: 101909)
  12. Rat antimouseST2-BV421 (BDBiosciences, catalog number: 566309)
  13. Rat antimouseKLRG1-BB630 (BDBiosciences, catalog number: custom)
  14. Rat antimouseMHC II-FITC (eBioscience, catalog number: 11-5321-82)
  15. Rat antimouseCD69-BB780 (BDBiosciences, custom)
  16. Rat antimouseIL17RB-BV605 (BDBiosciences, catalog number: 743817)
  17. Mouse antimouseGATA3-BUV395 (BDBiosciences, catalog number: 565448),
  18. Mouse antimouseRORγt-BV786 (BDBiosciences, catalog number: 564723)
  19. Mouse antimouseT-bet-PE (BDBiosciences, catalog number: 561268)

仪器设备

  1. 水平摇床 (其林贝尔，model: TS-100)
  2. CO2细胞培养箱 (Thermo ScientificTM HeracellTM 150i)
  3. 实验室2级生物安全柜 (Thermo ScientificTM 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
  4. 高速离心机 (Thermo ScientificTM SorvallTM ST 40 离心机)
  5. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
  6. 血细胞计数板 (Sigma-Aldrich,model: BR717805-1EA)
  7. X30流式细胞分析仪 (BD FACSymphonyTM系统)
  8. 电动移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：章晶晶, 沈蕾. (2019). 肠道固有淋巴样细胞亚群分类及表型检测. Bio-101: e1010327. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327.
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How to cite: Zhang, J. J. and Shen, L. (2019). Classification and Phenotype Analysis of Mouse Intestinal Innate Lymphoid Cells (ILCs). Bio-101: e1010327. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分离 > 淋巴细胞

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