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肠道固有淋巴样细胞亚群细胞因子分泌检测

Cytokine Secretion Analysis of Mouse Intestinal Innate lymphoid Cells (ILCs) by Flow Cytometry

章 章晶晶
沈 沈蕾

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010326 浏览次数: 8559

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流式细胞术实验手册
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摘要:固有淋巴样细胞 (ILCs) 是近年来新发现的一群缺乏T、B细胞抗原特异性受体的天然免疫细胞亚群，主要分布在器官和黏膜组织，对维持组织稳态具有重要调节作用。ILCs广泛参与抗感染、炎症反应、组织修复以及代谢调控等生物学过程，主要通过其分泌的效应性细胞因子和其他细胞相互作用，从而调节组织和器官的免疫微环境。因此，检测固有淋巴样细胞分泌细胞因子的情况对阐明其免疫调节作用至关重要。本实验将结合现有的文献报道，用流式细胞术检测目前已知的固有淋巴样细胞各亚群分泌的各类细胞因子，从而揭示不同亚群发挥的免疫调节作用。

Keywords: 固有淋巴样细胞 search 细胞因子检测 search

材料与试剂

材料：

  1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: 430791)
  2. 5 ml离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
  3. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
  4. 6孔板 (Corning, catalog number: 3516)
  5. 10 cm培养皿 (上海雷布斯，catalog number: 350003)
  6. 眼用手术剪 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYY1030)
  7. 眼用镊 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1030)
  8. 70 μm滤膜 (Corning, catalog number: 352350)
  9. 0.22 μm过滤器
  10. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
  11. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
  12. 3 ml圆头吸管 (Biologix，30-0138A1)
  13. 48孔板 (Corning, catalog number: 351178)
  14. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)

试剂：
  1. Dnase I (Sigma-Aidrich，DN25-1G，配成150 mg/ml的母液，-80 °C保存)
  2. Type VIII Collagenase (Sigma-Aidrich，C2139-1G，配成100 KU/ml的母液-80 °C保存)
  3. Lonsera乌拉圭 (南美) 特级胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
  4. 20x PBS缓冲液 (生工，catalog number: B548117)
  5. 无水酒精 (常熟市鸿盛精细化工有限公司，catalog number: 64-17-5)
  6. 0.5 mol/L EDTA (生工，catalog number: B300599)
  7. 二硫苏糖醇DTT (Sigma-Aidrich, catalog number: D9779-1G)
  8. RPMI 1640培养基 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
  9. Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) 双抗 (P/S, Gibco, catalog number: 15140-122) 
  10. Percoll (GE Healthcare, catalog number: 17-0891-09)
  11. eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscienceTM, catalog number: 00-5523-00)
  12. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
  13. PMA (Sigma-Aldrich，catalog number: P1585-1MG，配成1 mg/ml母液，-80 °C保存)
  14. Ionomycin calciumsalt (ENZO，ALX-450-007-M001，配成1 mg/ml母液，-80 °C保存)
  15. Brefeldin A Solution (1,000x) (BFA, Biolegend, catalog number: 42060) 
  16. 丙三醇
  17. 离子霉素
  18. DMSO
  19. Permeabilization Buffer
  20. Fixation/Permeabilization Concentrate
  21. Fixation/Permeabilization Diluent
  22. 1x PBS (见溶液配方)
  23. 75%酒精 (见溶液配方)
  24. 洗液1 (见溶液配方)
  25. 洗液2 (见溶液配方)
  26. 消化液 (见溶液配方)
  27. 1640完全培养基 (见溶液配方)
  28. DNase I母液 (见溶液配方)
  29. Collagenase VIII胶原酶母液 (见溶液配方)
  30. 40% Percoll (见溶液配方)
  31. 80% Percoll (见溶液配方)
  32. PMA和离子霉素刺激剂 (见溶液配方)
  33. 细胞活力染料溶液 (见溶液配方) 
  34. FACS buffer (见溶液配方)
  35. PMA母液 (见溶液配方)
  36. 离子霉素母液 (见溶液配方)
  37. CD16/32 block染料抗体 (见溶液配方)
  38. 抗体混合物溶液 (见溶液配方)
  39. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)
  40. 1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)

抗体：
  1. Fixable Viability Stain 520 (FITC) (BD Biosciences, catalog number: 564407)
  2. TruStainfcXTM (anti-mouse CD16/32) (Biolegend, catalog number: 101320)
  3. Hamster anti-Mouse CD3-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562286)
  4. Rat anti-mouse B220-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562290)
  5. Rat anti-mouseGr1-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562710)
  6. Rat anti-mouseCD11b-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562287)
  7. Hamster anti-mouseCD11c-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562454)
  8. CD45.2-BB660 (BD Biosciences, custom)
  9. CD127-PE-Cy7 (BD Biosciences, catalog number: 560733)
  10. T-bet-BV711 (BD Biosciences, catalog number: 563320)
  11. GATA3-BUV395 (BD Biosciences, catalog number: 565448)
  12. RORγt-BV786 (BD Biosciences, catalog number: 564723)
  13. IL-5-APC (BD Biosciences, catalog number: 554396)
  14. IL-17A-AF700 (BD Biosciences, catalog number: 560820)
  15. IFNγ-APC-Cy7 (BD Biosciences, catalog number: 561479)
  16. IL-22-PE (Biolegend, catalog number: 516404)

仪器设备

  1. 水平摇床 (其林贝尔，model: TS-100)
  2. CO2细胞培养箱 (Thermo ScientificTM HeracellTM 150i)
  3. 实验室2级生物安全柜 (Thermo ScientificTM 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
  4. 高速离心机 (Thermo ScientificTM SorvallTM ST 40 离心机)
  5. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
  6. 血细胞计数板 (Sigma-Aldrich,model: BR717805-1EA)
  7. X30流式细胞分析仪 (BD FACSymphonyTM系统)
  8. 电动移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：章晶晶, 沈蕾. (2019). 肠道固有淋巴样细胞亚群细胞因子分泌检测. Bio-101: e1010326. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010326.
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How to cite: Zhang, J. J. and Shen, L. (2019). Cytokine Secretion Analysis of Mouse Intestinal Innate lymphoid Cells (ILCs) by Flow Cytometry . Bio-101: e1010326. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010326.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分离 > 淋巴细胞

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