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肠道固有层单核吞噬细胞和细胞因子分泌的流式检测

Flow Cytometry of Intestinal Mononuclear Phagocytic Subsets and Functions

温 温珍亮*
苏 苏小惠*
陈 陈德昌
张 张李迪
牛 牛泓深
沈 沈蕾

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010324 浏览次数: 12251

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流式细胞术实验手册
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摘要：肠道固有层单核吞噬细胞主要包括巨噬细胞和树突状细胞，依据细胞表面表达的标志物CD11b、CX3CR1和CD103等表达水平不同分为不同的亚群。尽管各亚群功能各异，但均在维持肠道稳态中发挥着重要作用。流式细胞术能快速检测单个细胞的生物学性质，是研究免疫细胞的常用方法。在此，我们报告一项10色16参数的流式方案，以用于检测分析肠道单核吞噬细胞亚群和细胞因子。

Keywords: 肠道固有层 search 单核吞噬细胞 search 巨噬细胞 search 树突状细胞 search


研究背景：肠道固有层单核吞噬细胞包括巨噬细胞和常规树突状细胞 (conventional dendritic cells, cDCs)，在肠道黏膜稳态、感染和炎症中起重要作用 (Joeris等，2017)。和其他组织一样，肠道固有层巨噬细胞高表达表面抗原F4/80及CD11b，依据其表面趋化因子受体CX3CR1表达水平和功能的不同可分为炎性巨噬细胞 (inflammatory macrophages, IMs) 和驻留巨噬细胞 (resident macrophages, RMs) (Grainger等，2017)。前者低表达或中度表达CX3CR1，产生肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)、白介素6 (IL-6) 和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)，具有强烈的促炎特性，负责招募炎性免疫细胞 (如中性粒细胞) 至病变部位，同时也可限制中性粒细胞功能，防止炎症过度激活放大 (Grainger等，2017)。后者高表达CX3CR1，具有很强的吞噬活性，同时分泌较多白介素10 (IL-10) 及少量TNF-α，维持局部Treg数量，参与组织修复及上皮再生 (Grainger等，2017；Joeris等，2017)。同样，肠道固有层cDCs也高表达主要组织相容性复合物II (MHC-II) 和表面分子CD11c。尽管肠道cDCs有很多种分类方法 (周光炎，2013；Si等，2016；Joeris等，2017)，但依据功能不同主要分为效应性DCs和调节性DCs (周光炎，2013)。前者表达表面分子CD11b及CX3CR1，分泌白介素12 (IL-12)、TNF-α等，激活Th1细胞及Th17细胞，诱导保护性炎症反应；后者表达整合素αE (CD103)，不表达CX3CR1，分泌IL-10、TGF-β，激活FoxP3+Treg，抑制机体对抗原和共生菌的应答 (周光炎，2013)。在此，我们构建一套10色16参数的流式方案，首先通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞，去除细胞碎片及粘连体。通过LIVE/DEAD和CD45.2圈出活的CD45.2+免疫细胞，并使用Linage (CD3，B220，GR-1) 去除T细胞、B细胞、粒细胞，以减少干扰。接着将F4/80+CD11b+细胞定义为巨噬细胞，根据CX3CR1的表达，将巨噬细胞分为IMs (F4/80+CD11b+CX3CR1-/int)和RMs (F4/80+CD11b+CX3CR1hi)；同时将F4/80-MHC-II+CD11c+细胞定义为cDCs，cDCs可进一步分为两个亚群：调节性DCs (CD103+CX3CR1-) 和效应性DCs (CD11b+CX3CR1+)。在这套流式方案里，我们还加入了细胞因子 (IL-10，TNF-α) 以检测巨噬细胞细胞因子分泌情况。
        总之，我们描述了肠道固有层单核吞噬细胞的获取方法并提出一项10色16参数的流式方案，将有助于分离和定义肠道巨噬细胞和cDCs这两个群体，以便进一步的表型分析和功能表征。

材料与试剂

耗材：

  1. 1.5 ml尖底离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
  2. 5 ml带盖离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
  3. 15 ml尖底离心管 (Corning, catalog number: 430791)
  4. 50 ml尖底离心管 (Corning, catalog number: 430829)
  5. 3 ml圆头吸管 (Biologix, catalog number: 30-0138A1)
  6. 10 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-300)
  7.  200 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-200-Y)
  8. 1,000 μl移液器吸头 (Axygen, catalog number: T-1000-B)
  9. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
  10. 90 cm培养皿 (Bioinspl, catalog number: GD9100)
  11. 6孔板 (Corning, catalog number: 3516)
  12. 96孔板 (Corning, catalog number: 3360)
  13. 5 ml Falcon聚苯乙烯圆底管 (Corning, catalog number: 352052)
  14. 70 μm滤器 (Corning, catalog number: 352350)
  15. 0.22 μm滤器 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
  16. 剪刀 (苏州施强医疗器械有限公司，catalog number: JYJ1030D)
  17. 镊子 (苏州施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1020)
  18. 细胞计数板 (Marienfeld, catalog number: 0650030)

动物：

SPF级野生型C57BL/6雄性小鼠 (上海灵畅实验动物有限公司)，8~10w，饲养于屏障温控房，12 h昼夜交替，温度20~22 °C，湿度30%~70%。所有实验均经上海交通大学医学院动物护理与使用委员会批准

 抗体：

  1. 抗CD16/32 (克隆号：93，BioLegend，catalog number: 101320，工作稀释度1/50)
  2. 抗CD45.2 (克隆号：104，eBioscience，catalog number: 56-0454-82，工作稀释度1/200)
  3. 抗CD3e (克隆号：145-2C11，BD Biosciences，catalog number: 557596，工作稀释度1/200)
  4. 抗B220 (克隆号：RA3-6B2，BD Biosciences，catalog number: 552094，工作稀释度1/200)
  5. 抗Gr-1 (克隆号：RB6-8C5，BioLegend，catalog number: 108424，工作稀释度1/200)
  6. 抗F4/80 (克隆号：BM8，eBioscience，catalog number: 17-4801-82，工作稀释度1/200)
  7. 抗CD11b (克隆号：M1/70，BioLegend，catalog number: 101256，工作稀释度1/200)
  8. 抗CX3CR1 (克隆号：SA011F11，BioLegend，catalog number: 149023，工作稀释度1/200)
  9. 抗MHC-II (克隆号：AF6-120.1，eBioscience，catalog number: 11-5320-82，工作稀释度1/200)
  10. 抗CD11c (克隆号：HL3，BD Biosciences，catalog number: 558079，工作稀释度1/200)
  11. 抗CD103 (克隆号：M290，BD Biosciences，catalog number: 564322，工作稀释度1/200)
  12. 抗IL-10 (克隆号：JES5-16E3，BD Biosciences，catalog number: 563277，工作稀释度1/100)
  13. 抗TNF-α (克隆号：MP6-XT22，eBioscience，catalog number: 12-7321-82，工作稀释度1/100)

试剂：
  1. 胎牛血清 (FBS, Lonsera, catalog number: S711-001S)
  2. 胶原酶VIII (Collagenase VIII, Sigma-Aldrich, catalog number: C2139)
  3. 脱氧核糖核酸酶I (DNase I, Sigma-Aldrich, catalog number: DN25)
  4. 二硫苏糖醇 (DTT, Sigma-Aldrich, catalog number: D9779)
  5. 乙二胺四乙酸二钠盐二水 (Na2EDTA·2H2O，上海生工，catalog number: 205-358-3)
  6. 氯化钠 (NaCl，上海生工，catalog number: 7647-14-5)
  7. 磷酸氢二钠十二水 (Na2HPO4·12H2O，上海生工，catalog number: 10039-32-4)
  8. 无水磷酸二氢钾 (KH2PO4，上海生工，catalog number: 7778-77-0)
  9. N-(2-羟乙基)哌秦-N'-2-乙烷磺酸 (HEPES, Biosharp, catalog number: BS029C)
  10. RPMI 1640 (GE, catalog number: SH3080901)
  11. Percoll细胞分离液 (GE, catalog number: 17-0891-011) 
  12. Brefeldin A Solution (BFA，BioLegend，catalog number: 420601，工作稀释度1/1000)
  13. Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience, catalog number: 00-5523-00)
  14. LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit-APC-Cy7 (eBioscience，catalog number: L10119，工作稀释度1/1000)
  15. Fixation/Permeabilization原液
  16. Fixation/Permeabilization稀释液
  17. 台盼蓝溶液
  18. NaOH
  19. 丙三醇
  20. 1x PBS缓冲液 (见溶液配方)
  21. 10x PBS缓冲液 (见溶液配方)
  22. 1000x DTT溶液 (见溶液配方)
  23. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 溶液 (见溶液配方)
  24. 1 M HEPES溶液 (见溶液配方)
  25. 解离液1 (见溶液配方)
  26. 解离液2 (见溶液配方)
  27. 胶原酶VIII母液 (见溶液配方)
  28. DNA酶 I母液 (见溶液配方)
  29. 消化液 (见溶液配方)
  30. 含10%FBS的RPMI1640培养液 (见溶液配方)
  31. 40% Percoll溶液 (见溶液配方)
  32. 80% Percoll溶液 (见溶液配方)
  33. 细胞死活染料工作液 (见溶液配方)
  34. FACS缓冲液 (见溶液配方)
  35. Fc block工作液 (见溶液配方)
  36. 细胞表面抗原抗体混合液 (见溶液配方)
  37. Fixation/Permeabilization工作液 (见溶液配方)
  38. Permeabilization洗液工作液 (见溶液配方)
  39. 细胞胞内抗原抗体混合液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 高压蒸汽灭菌锅 (TOMY, model: SX-500)
  2. 超净工作站 (Thermo Scientific, model: 1300SERIESA2)
  3. 台式恒温振荡器摇床 (上海智城，model: ZWY-200D)
  4. 冷冻台式离心机 (Thermo Scientific, model: SORVALL ST40R)
  5. CO2培养箱 (Thermo Scientific, model: HERACELL 150i)
  6. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
  7. -20 °C低温冰箱 (Haier, model: DW25L262)
  8. 4 °C冰箱 (Haier, model: HYC-940)
  9. 流式分析仪 (BD, model: LSRFortessa)
  10. 磁力搅拌器

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：温珍亮, 苏小惠, 陈德昌, 张李迪, 牛泓深, 沈蕾. (2019). 肠道固有层单核吞噬细胞和细胞因子分泌的流式检测. Bio-101: e1010324. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010324.
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How to cite: Wen, Z. L., Su, X. H., Chen, D. C., Zhang, L. D., Niu, H. S. and Shen, L.  (2019). Flow Cytometry of Intestinal Mononuclear Phagocytic Subsets and Functions. Bio-101: e1010324. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010324.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分离 > 巨噬细胞

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