材料与试剂

1.  平皿盖
2.  剪刀
3. 滤膜 (40 μm, 70 μm)
4. 胶原酶III (Worthington, catalog number: LS004183)
5. DNase I (Sigma-Aldrich, catalog number: D4263)
6. 胎牛血清 (HyClone, catalog number: SH30396.03)
7. 胶原蛋白酶III
8.  流式抗体来源及使用浓度 (表1)
   
       表1. 流式抗体来源及使用浓度
   
   
9. Trypsin-EDTA 0.05% phenol red (invitrogen, catalog number: 25300062)
10.  RPMI 1640培养液 (Gibco, catalog number: C1187550BT)
11.  DMEM高糖培养液 (Hyclone, catalog number: SH30243.01)
12. PBS
13. 消化缓冲液
14. DMEM培养基
15. 红细胞裂解液 (Sigma-Aldrich, catalog number: R7757)
16. PS双抗
    
17. 组织消化液（见溶液配方）

仪器设备

1. 流式细胞仪FACSJazz (Becton Dickinson)
2. 细胞培养箱 (Esco)
3. 冷冻离心机 (Eppendorf)
4. 生物安全柜 (Esco)
5. 天平 (Sartorius)
6. 摇床 (Tensuc)
7. 水浴锅

实验步骤

一． 获取乳腺组织及消化

1. 配制组织消化缓冲液：在RPMI 1640培养液中，加入5%的胎牛血清，1%的PS双抗，25 mM HEPES (pH 8.0)。37 °C水浴锅中预热备用。
2. CO₂箱中安乐死小鼠。收取小鼠乳腺，PBS清洗后，放到6 cm平皿盖中，用剪刀剪碎组织至肉糜状，称取组织重量。
3. 按照每克乳腺组织10 ml消化液准备好消化缓冲液，放在50 ml离心管中 (不超过30 ml/管)。加入胶原蛋白酶3 (终浓度300 U/ml)。将剪碎的组织加入配好的消化缓冲液中，摇匀。。
   
4. 将装有组织的离心管平放在37 °C摇床中，100转/分钟，消化2 h，期间每15 min剧烈摇晃一次。组织充分消化后，消化液呈均一状态，无肉眼可见组织块，只有脂肪滴浮在液体表面。
   

二．分离单细胞

1. 取出组织消化液，用常温的PBS补齐50 ml体积。201 × g，4 °C离心使细胞沉淀。离心时升速的加速度为9，降速的加速度为0或1, 离心5 min。
2. 去除上层脂肪及上清，加入1~2 ml红细胞裂解液，轻弹重悬沉淀，室温静置5 min。转移细胞到15 ml离心管中，加入PBS补齐15 ml。
3. 201 × g，4 °C离心5 min使细胞沉淀，吸除上清。加入2 ml预热的0.05% trypsin-EDTA重悬沉淀，37 °C培养箱中孵育5 min, 期间轻弹管壁一次使细胞更好地消化。此时会形成白色絮状细胞团，这是由于死亡细胞释放DNA导致的。
4. 加入2 ml预热的无血清DMEM培养基，再加入0.1 mg/ml 的DNase I，放在37 °C继续孵育5 min。期间，轻弹管壁使更多的单细胞释放出来。用10 ml含5%胎牛血清的PBS终止胰酶反应。
5. 将细胞通过70 μm滤膜过滤，去除细胞团块。201 × g，4 °C离心5 min，吸除上清；用预冷的5%的胎牛血清重悬沉淀 (大约每4个乳腺150~200 μl体积)，置于冰上备用。
   

三．流式分选乳腺干细胞

1. 取出少量细胞进行单色抗体染色 (约50 μl)，用于FACS时做颜色补偿。剩余细胞加入一抗染色，冰上孵育20 min。期间轻弹细胞沉淀以使细胞能够充分染色。
2. 用含5%胎牛血清的PBS补齐15 ml体积后离心，吸除上清，用500~1,000 μl 5%的胎牛血清重悬沉淀，冰上孵育二抗20 min。
3. 离心，5%的胎牛血清重悬沉淀，通过40 μm滤膜过滤细胞，做好分选准备。
4. 进行流式分选，用含50%胎牛血清的PBS承接分选到的细胞。15 ml管中预放7~8 ml承接液。

结果与分析

如图1所示，在小鼠乳腺单细胞悬液中框取FSC较大的活细胞 (SSC选择log展示)。接着去掉粘连细胞，框取单细胞。在单细胞中选择CD31/CD45/Ter119阴性的细胞。根据CD24和CD29的表达框取luminal，basal和stroma细胞。Basal细胞为CD24⁺CD29^high的一群。根据之前的报道，乳腺干细胞特异性存在于basal细胞层中，在成年 (8w及以上) ICR品系的小鼠乳腺中占3%左右。


图1. 小鼠乳腺干细胞分选示意图

失败经验

如果存在单细胞得率低的情况，可以考虑从以下几点改进：

1. 第一步消化不够充分：组织在消化前可以剪得更碎一些；在消化过程中，可以更加剧烈地摇晃以使组织更加充分地消化。
2. 在胰酶和DNA酶处理时细胞损失：如果胰酶和DNA酶消化不够完全，可能导致细胞形成团块，留在滤膜上，从而减少单细胞得率。如果出现这种情况，可以适当增加处理的强度，可以用移液器吹打团块细胞，使更多的单细胞释放出来。
   
   

如果出现细胞分群不好的情况，可以考虑：

1. 单细胞少，很多细胞是由2~3个细胞组成的细胞团块。
2. 在加抗体孵育过程中，细胞过多形成沉淀。在冰上孵育时，应该过10分钟轻弹一次沉淀，使细胞能够更充分地染色。

溶液配方

1. 组织消化液
   在RPMI 1640培养液，加入5%的胎牛血清，1%的PS双抗，25 mM HEPES (pH 8.0)。使用之前加入300 U/ml的胶原蛋白酶III
   

致谢

曾艺实验室的工作得到国家自然基金的支持。本文实验方案用于本实验室发表的文章 (Cai等, 2014; Wang等, 2015; Song等, 2019)。

参考文献

1. Cai, C., Yu, Q. C., Jiang, W., Liu, W., Song, W., Yu, H., Zhang, L., Yang, Y. and Zeng, Y. A. (2014). R-spondin1 is a novel hormone mediator for mammary stem cell self-renewal. Genes Dev 28: 2205-2218.
2. Song, W., Wang, R., Jiang, W., Yin, Q., Peng, G., Yang, R., Yu, Q. C., Chen, J., Li, J., Cheung, T. H., Jing, N. and Zeng, Y. A. (2019). Hormones induce the formation of luminal-derived basal cells in the mammary gland. Cell Res 29(3): 206-220.
3. Wang, D., Cai, C., Dong, X., Yu, Q. C., Zhang, X. O., Yang, L. and Zeng, Y. A. (2015). Identification of multipotent mammary stem cells by protein C receptor expression. Nature 517(7532): 81-84.