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嵌合抗原受体T细胞体外肿瘤杀伤的流式检测

Analyzing Cytotoxicity Capacity of Chimeric Antigen Receptor T-cell in vitro by Flow Cytometry

张 张晓卿
杨 杨选明

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010316 浏览次数: 6160

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流式细胞术实验手册
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摘要：嵌合抗原受体T细胞 (CAR-T)，是通过基因工程手段进行修饰的T细胞。胞外区含有不受MHC限制的单链可变区 (scFv)，可特异识别抗原 (如CD20等)；胞内区含有共刺激结构域 (CD28，4-1BB等) 和第一信号激活结构域 (CD3ζ)，进行信号传递 (Eshhar等，1993；Sadelain等，2013)。CD20 CAR-T可特异的识别并杀伤表达CD20的人B淋巴瘤细胞系Raji (Kowolik等，2006)。在体外，CD20 CAR-T与靶细胞Raji以不同比例共培养24小时，使用不同抗体分别标记CAR-T细胞和靶细胞，通过流式细胞技术确定CD20 CAR-T杀伤功能。

Keywords: CAR-T search 靶细胞 search 流式细胞技术 search T细胞杀伤 search

材料与试剂

  1. 96孔板 (U型) (Jet Biofil, catalog number: 011096)
  2. Falcon细胞流式管 (BD, catalog number: 352054)
  3. 离心管 (Jet Biofil, catalog number: CFT011550)
  4. Raji 细胞 (ATCC® CCL-86TM)
  5. 抗体：
    APC-anti-human CD19 (BioLegend, catalog number: 302212)
    FITC-anti-human CD3 (BioLegend, catalog number: 317306)
  6. 胎牛血清 (FBS) (Gibco, catalog number: 10270)
  7. RPMI 1640培养基 (Hyclone, catalog number: SH30809.01)
  8. Penicillin/streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
  9. 台盼蓝 (Trypan Blue) (Sigma-Aldrich, catalog number: T8154)
  10. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Amresco, catalog number: 0482)
  11. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900058-500g)
  12. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number: V900068-500g)
  13. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900060-500g)
  14. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number: V900041-500g)
  15. Na3N (Amresco, catalog number: 0639-250g) 
  16. IL-2 (北京四环生物制药有限公司，catalog number: 国药准字S10970018)
  17. L-Glutamine (200 mM)
  18. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
  19. FACS buffer (1 L) (见溶液配方)
  20. T细胞培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 流式细胞仪 (Beckman Coulter, model: Cytoflex S)
  2. 电动吸引器 (斯曼峰，model: YX930D)
  3. 移液器 (Eppendorf)
  4. 正置光学显微镜 (Olympus, model: IX2-SLP)
  5. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
  6. 医用低温保存箱 (海尔，model: DW-25L262/BD-226W)
  7. 振荡混匀机 (kylin-bell)
  8. 生物安全柜 (LabGard, model: Class II/Labconco)
  9. 天平 (Sartorius, model: BSA124S)
  10. 高压灭菌锅 (上海博迅实业有限公司，model: YXQ-LS-100S11)

软件

  1. FlowJo

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：张晓卿, 杨选明. (2019). 嵌合抗原受体T细胞体外肿瘤杀伤的流式检测. Bio-101: e1010316. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010316.
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How to cite: Zhang, X. Q. and Yang, X. M. (2019). Analyzing Cytotoxicity Capacity of Chimeric Antigen Receptor T-cell in vitro by Flow Cytometry. Bio-101: e1010316. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010316.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分化 > T 细胞

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