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胞内染色法检测T细胞活化产生的细胞因子

Analyzing Cytokines Production during T Cell Activation by Flow Cytometry Intracellular Staining

韩 韩萍
杨 杨选明

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010314 浏览次数: 7747

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流式细胞术实验手册
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摘要：T细胞经过抗原刺激活化后，会发生一系列的变化 (Yang等，2014a和2014b; Pu等，2016)，如表达表面活性分子、产生特定的细胞因子、细胞增殖分裂及细胞凋亡等，利用流式细胞仪可以在单细胞水平上对其进行多参数检测 (Yang等，2014b)，如：活化T细胞的表面分子 (如CD44、CD69等) 及其相应的效应分子 (如Granzyme B、IFN-γ及Perforin等)，从而对抗原特异性免疫反应在细胞水平进行定性和定量分析。本次实验中，我们利用含OVA模式抗原的小鼠黑色素瘤细胞B16-OVA对OT-IT细胞给予刺激，24h后检测胞内细胞因子IFN-γ的表达，对照组OT-IT细胞无肿瘤细胞刺激。

Keywords: 流式检测 search T细胞活化 search 细胞因子 search 胞内染色 search

材料与试剂

  1. 96孔板 (Jet Biofil, catalog number: TCP001096)
  2. OT-I小鼠 (Jackson Lab)
  3. Anti-mCD8-AF700 (BioLegend, catalog number: 100730)
  4. Anti-IFN-γ-APC (BioLegend, catalog number: 505810)
  5. anti-CD16/32 抗体 (clone 2.4G2) (BioLegend, catalog number: 101301)
  6. B16-OVA细胞 (芝加哥大学Hans Schreiber馈赠)
  7. FBS (Gibco, catalog number: 10270-106)
  8. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01B)
  9. RPMI 1640培养基 (Hyclone, catalog number: SH30027.01)
  10. 双抗Penicillin/Streptomycin (Hyclone, catalog number: SV30010)
  11. 10x Permeabilization Buffer (eBioscience, catalog number: 00-8333-56)
  12. BFA (Brefeldin A) (BioLegend, catalog number: 420601)
  13. 多聚甲醛 (Adamas, catalog number: 46556A)
  14. NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number：V900058-500g)
  15. KCl (Sigma-Aldrich, catalog number：V900068-500g)
  16. Na2HPO4 (Sigma-Aldrich, catalog number：V900060-500g)
  17. KH2PO4 (Sigma-Aldrich, catalog number：V900041-500g)
  18. NaN3 (Amresco, catalog number: 0639-250g)
  19. NaOH (Sigma-Aldrich, catalog number: V900797)
  20. 10× PBS (1 L, pH = 7.3) (见溶液配方)
  21. FACS buffer (见溶液配方)
  22. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 生物安全柜 (LabGard, model: Class II/Labconco) 
  2. 离心机 (Eppendorf, model: 5810R) 
  3. 光学显微镜 (Olympus, model: IX2-SLP)
  4. 流式细胞仪 (Backman Coulter, model: CytoFLEX S)
  5. 移液器 (Eppendorf)
  6. 二氧化碳培养箱 (Panasonic, model: MCO-20AIC)
  7. 高压蒸汽灭菌锅 (Boxun，model: YXQ-LS-100SII)

软件

  1. FlowJo 软件

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：韩萍, 杨选明. (2019). 胞内染色法检测T细胞活化产生的细胞因子. Bio-101: e1010314. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010314.
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How to cite: Han, P. and Yang, X. M. (2019). Analyzing Cytokines Production during T Cell Activation by Flow Cytometry Intracellular Staining. Bio-101: e1010314. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010314.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 免疫细胞分化 > T 细胞

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