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肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法

The Detection of Dendritic Cell Subsets and Maturation in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry

杨 杨超*
金 金静思*
邓 邓刘福

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010310 浏览次数: 12992

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流式细胞术实验手册
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摘要：树突状细胞是一群功能强大的抗原提呈细胞，是联系固有免疫和特异性免疫的中坚力量。cDC表达CD11c和MHCII，可分为cDC1和cDC2两个不同的亚群 (Guilliams等，2014)。cDC1s分化依赖于转录因子BATF3，IRF8和ID2，表达趋化因子受体XCR1；在小鼠肿瘤模型中，一般加用整合素αE分子 (CD103) 来标记 (Salmon等，2016)。而cDC2s的分化依赖于转录因子RELB，IRF4和ZEB2，表面表达CD11b和CD172a分子可使其与cDC1s亚群区分开。cDC1s主要执行交叉提呈肿瘤抗原，激发CD8+T细胞杀伤效应，已被广泛研究证实是肿瘤排异反应及肿瘤免疫治疗的关键亚群 (Bottcher等，2018)。本文阐述如何运用流式技术检测肿瘤微环境内DC亚群及其成熟标志，为相关研究作铺垫。

Keywords: 树突状细胞 search 肿瘤微环境 search 流式技术 search

材料与试剂

材料：

  1. 眼科剪及眼科镊
  2. 1 ml移液枪及枪头
  3. 6孔细胞培养平底板 (NEST®, catalog number: 032819AA01)
  4. 96孔细胞培养U底板 (NEST®, catalog number: 112518AA03)
  5. 15 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339650)
  6. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339652)
  7. 无菌注射器 (上海康德莱企业发展有限公司，KDL®)
  8. 70 μm孔径滤网 (Corning, Falcon®, catalog number: 352350)
  9. 5 ml无菌圆底管 (带滤网) (Corning, Falcon®, catalog number: 352235)

试剂：

  1. 胎牛血清 (Gemini, FoundationTM, catalog number: 900-108)
  2. Anti-FcR (CD16/CD32) 抗体 (BioXCel, catalog number: BE0307)
  3. 胶原蛋白酶I (Worthington Biochemical®, catalog number: LS004186，-20°C储存)
  4. 脱氧核糖核酸酶I，来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich®, catalog number: DN25，-20°C储存) 
  5. DMEM基础高糖培养液 (HycloneTM, catalog number: SH30243.01)
  6. PBS (HycloneTM, catalog number: SH302560.31)
  7. 乙醇
  8. 5% DMEM培养液 (见溶液配方)
  9. FACS buffer (见溶液配方)
  10. 肿瘤组织消化液 (见溶液配方)
抗体：
  1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307)
  2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience, BD, catalog number: 565388)
  3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend,  catalog number: 109839)
  4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend, catalog number: 128035)
  5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend,  catalog number: 127643)
  6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend, catalog number: 101216)
  7. Anti-mouse-CD11c-APC (Biolegend,  catalog number: 117310)
  8. Anti-mouse-CD103-APC/Cy7 (Biolegend, catalog number: 121432)
  9. Anti-mouse-F4/80-BV421 (Biolegend, catalog number: 123137)
  10. Anti-mouse-CD86-FITC (Biolegend, catalog number: 105005)
  11. Anti-mouse-MHC class II (I-A/I/E)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend,  catalog number: 107625)

仪器设备

  1. 37 °C二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific)
  2. 电热恒温水槽 (上海一恒科学仪器有限公司，model：DK-8AXX)
  3. 低温离心机 (Eppendorf®, model: 5810R)
  4. 微型台式真空泵GL-802B型 (Kylin-bell®, model: GL-802B型)
  5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent)
  6. 恒温细胞培养箱
  7. 超净工作台

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：杨超, 金静思, 邓刘福. (2019). 肿瘤微环境内DC细胞亚型和成熟流式检测方法. Bio-101: e1010310. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010310.
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How to cite: Yang, C., Jin, J. S. and Deng, L. F. (2019). The Detection of Dendritic Cell Subsets and Maturation in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry. Bio-101: e1010310. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010310.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

癌症生物学 > 肿瘤免疫学 > 细胞生物学试验

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