材料与试剂

1. 96孔板
2. Dynabeads mons t activator CD3/CD28 (Gibco, catalog number: 11452D)
3. Purified NA/LE hamster anti mouse CD3e (BD, catalog number: 553057)
4. Purified NA/LE hamster anti mouse CD28 (BD, catalog number: 553294)
5. Anti-mouse IL-4 (BD, catalog number: 554434)
6. Murine IL-12 (Pepro Tech, catalog number: 2101210)
7. Murine IL-2 (Pepro Tech, catalog number: 2121220)
8. Murine IL-4 (Pepro Tech, catalog number: 214145)
9. Anti- mouse IFN-γ (BD, catalog number: 551216)
10. Anti- mouse IL-12 (BD, catalog number: 551219)
11. Murine IL-6 (Pepro Tech, catalog number: 21616)
12. Human TGF-β1 (Pepro Tech, catalog number: 10021C10)
13. Murine TNF-α (Pepro Tech, catalog number: 31501A5)
14. Murine IL-1β (Pepro Tech, catalog number: 21111B)
15. Easysep^TM mouse naïve CD4⁺ T cells isolation kit (Stem cell, catalog number: 19725A)
16. β-Mercaptoethanol (Millipore, catalog number: ES007E)
17. PBS
18. 1640培养基
19. IMDM培养基 
20. 谷氨酰胺
21. 双抗
22. 1640完全培养基 (见溶液配方)
23. IMDM完全培养液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Thermo Fisher Scientific)
2. FACS LSR II流式细胞仪 (Becton Dickinson)
   

实验步骤

一.初始CD4⁺ T细胞分离
使用Easysep^TM mouse naïve CD4⁺ T cells isolation kit阴选出脾脏中的初始CD4⁺ T细胞 (naïve CD4+ T cells)。如果在96孔板中刺激诱导，每孔铺1 x 10⁵ naïve CD4⁺ T cells，以下均以1 x 10⁵细胞为例。

二.CD3和CD28预先铺板
Th0，Th1和Treg这3种细胞使用purified NA/LE hamster anti mouse CD3e和purified NA/LE hamster anti mouse CD28预先铺板，两个的铺板工作浓度均为1 μg/ml (PBS稀释)，96孔板铺板体积为50 μl。可在4 °C预铺12~16小时或者37 °C预铺2小时。
Th17细胞铺板浓度不同，purified NA/LE hamster anti mouse CD3e工作浓度 2 μg/ml，CD28工作浓度 5 μg/ml。
预铺结束，缓慢吸走上清，开始洗板子，即缓慢加入1640完全培养液室温静止5分钟，吸走。洗三次，注意最后一次在加入细胞前再吸走培养液。

三.刺激分化

1. Th0细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：anti-IL-4: 10 μg/ml, anti-IFN-γ: 10 μg/ml；
2. Th1细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-12: 10 ng/ml, IL-2: 10 ng/ml, anti-IL-4: 10 μg/ml（图1）；
   
   
   图1. Th1细胞流式结果示意图
   
   
3. Th2细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-4: 10 ng/ml, IL-2: 5 ng/ml, anti-IFN-γ: 10 μg/ml, anti-IL-12 :10 μg/ml, 加CD3/CD28 beads: 2.5 μl beads (2.5 μl beads/10⁵ cells) (Cote-Sierra等, 2004, 图2)；
   注：Beads提前用1640完全培养液洗三遍,后加入培养液中。
   
   
   图2. Th2细胞流式结果示意图
   
   
4. Th17细胞培养: 每孔200 μl IMDM完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-6: 30 ng/ml, TGF-β: 3 ng/ml, TNF-α: 10 ng/ml, IL-1β: 10 ng/ml, anti-IFN-γ: 5 μg/ml, anti-IL-4: 5 μg/ml (Kleinewietfeld等, 2013, 图3)；
   
   
   图3. Th17细胞流式结果示意图
   
   
5. Treg细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-2: 5 ng/ml, TGFβ: 3 ng/ml (Freudenberg等, 2018, 图4)；
   
   
   图4. Treg细胞流式结果示意图
   
           72小时后轻轻吸走100 μl培养液，再次加入细胞因子种类及浓度和之前一样的100 μl培养液，再培养24小时后，PI reboost 3~4小时后检测各细胞诱导比例。

注意事项

1. 用加入细胞因子的培养液悬起细胞后，尽量轻柔的将细胞加到板里，避免吹起之前铺好的 anti-CD3/CD28抗体。
2. 当刺激细胞数量比较大时，48小时开始每12小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则立即铺加刺激，将培养液分到新的孔中，同样在最初刺激96小时后检测。96孔板最多培养初始3 x 10⁵细胞，更多细胞则需要按比例依次换更大的孔板。
   

溶液配方

1. 1640完全培养基
   1640培养基加10% FBS
   加双抗 (100x)
   加50 μM Mercaptoethanol 
2. IMDM完全培养液
   IMDM培养基加10% FBS
   加双抗 (100x)
   加谷氨酰胺 (100x)
   加5 μM Mercaptoethanol
   

致谢

此份实验操作方法是实验室多位师兄师姐查阅文献，并结合实际实验操作最终总结的实验方法，实验室后续多位同学验证可行。特此感谢实验室相关人员对此实验方法的贡献！

参考文献

1. Cote-Sierra, J., Foucras, G., Guo, L., Chiodetti, L., Young, H. A., Hu-Li, J., Zhu, J. and Paul, W. E. (2004). Interleukin 2 plays a central role in Th2 differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 101(11): 3880-3885. 
2. Freudenberg, K., Lindner, N., Dohnke, S., Garbe, A. I., Schallenberg, S. and Kretschmer, K. (2018). Critical Role of TGF-beta and IL-2 Receptor Signaling in Foxp3 Induction by an Inhibitor of DNA Methylation. Front Immunol 9: 125.
3. Kleinewietfeld, M., Manzel, A., Titze, J., Kvakan, H., Yosef, N., Linker, R. A., Muller, D. N. and Hafler, D. A. (2013). Sodium chloride drives autoimmune disease by the induction of pathogenic TH17 cells. Nature 496(7446): 518-522.