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小鼠肠道干细胞流式分选

FACS Isolation of Mouse Intestinal Stem Cell

陈 陈世阳
陈 陈剑峰

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306 浏览次数: 7051

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流式细胞术实验手册
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摘要：肠道黏膜上皮作为机体防御外界病原体的第一道防线，处于不断的自我更新和分化的状态，其自我更新的动力源于隐窝内的肠道干细胞。肠道干细胞具有持久的自我增殖和分化能力，从而维持肠道黏膜上皮快速的自我更新和损伤修复。通过流式细胞术富集分离出的肠道干细胞，不仅可以直接用于转录组、基因组测序等来研究干细胞的生物学特性，而且可以将分选得到的单个肠道干细胞进行体外的类器官培养 (Sato和Clevers，2013；Hamilton等，2015)。通过单个细胞表面标志分子如EphB2、CD24和CD166等进行肠道干细胞的流式分选，很难去除祖细胞以及部分已分化的细胞。有研究报道通过CD44+ CD24lo CD166+ GRP78lo/- c-Kit-等多个表面分子可以流式分选得到高效的肠道干细胞 (Wang等，2013)。对于小鼠肠道干细胞的分离，则可依赖于Lgr5-GFP的转基因小鼠来进行流式分选。本方案主要介绍利用Lgr5-GFP的荧光报告小鼠通过流式分选得到肠道干细胞的方法。

Keywords: 肠道干细胞 search 肠道隐窝 search 流式分选 search

材料与试剂

  1. 40 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431750)
  2. 70 μm细胞筛 (Corning, catalog number: 431751)
  3. 巴氏吸管 (3 ml，上海晶安)
  4. 10 cm dish (Griner, catalog number: 664160)
  5. FACS管 (BD Falcon)
  6. 15 ml，50 ml离心管 (Gene Brick)
  7. Lgr5-EGFP-ires-CreERT2 (Lgr5-GFP) mice (Jackson Laboratory, USA)
  8. FBS (NTC)
  9. Rat anti-CD45 (1:200, BD Biosciences, catalog number: 557659)
  10. Rat anti-CD31 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-0311-82)
  11. Rat anti-TER119 (1:500, eBioscience, catalog number: 12-5921-82)
  12. Rat anti- EpCAM (1:300, eBioscience, catalog number: 17-5791-82)
  13. Advanced DMEM/F12 (Life Technologies, catalog number: 12634028)
  14. HEPES (Sigma-Aldrich)
  15. GlutaMax (Gibco, catalog number: 35050061)
  16. Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140163)
  17. N2 supplement (Gibco, catalog number: A1370701)
  18. B27 supplement (Gibco, catalog number: 17504044)
  19. N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-Aldrich, catalog number: A9165)
  20. D-PBS (Ca2+/Mg2+ free，预冷)
  21. EDTA (Sigma-Aldrich)
  22. Y-27632 (Sigma-Aldrich, catalog number: Y0503)
  23. TrypLE Express (Gibco, catalog number: 12604021)
  24. 7-AAD Viability staining solution (Life Technologies, catalog number: 00-6993-50)
  25. Basal medium (见溶液配方)
  26. Sorting medium (见溶液配方)

仪器设备

  1. 眼用剪 (10 cm直剪, 上海三友, catalog number: 042000)
  2. 眼科镊 (10 cm弯,上海三友, catalog number: 044571)
  3. 电动移液器 (Eppendorf Easypet 3)
  4. 37 °C水浴锅 (上海精宏, catalog number: DK-420)
  5. 4 °C 离心机 (Eppendorf, model: 5804R)
  6. 流式分选仪器 (BD Aria III)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：陈世阳, 陈剑峰. (2019). 小鼠肠道干细胞流式分选. Bio-101: e1010306. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306.
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How to cite: Chen, S. Y. and Chen, J. F. (2019). FACS Isolation of Mouse Intestinal Stem Cell. Bio-101: e1010306. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010306.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

干细胞 > 成体干细胞 > 肠道干细胞

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