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Treg细胞功能的流式检测

Functional Analysis of Mouse Tregs by Flow Cytometry Analysis

朱 朱雪平*
周 周旭宇

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010305 浏览次数: 10435

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流式细胞术实验手册
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摘要：CD4+Foxp3+调节性T细胞 (Treg) 在控制自身免疫耐受和炎症反应方面发挥相当关键的作用 (Sakaguchi，2004)。研究表明，T细胞受体 (TCR) 信号控制Treg细胞的活化、维持和免疫抑制功能，并进而影响Treg细胞的基因表达、代谢、粘附和迁移以控制机体的免疫稳态和平衡 (Li和Rudensky，2016)。因此，研究Treg细胞的活化和免疫抑制功能具有重要的意义。在这里，基于运用荧光染料 (如CellTrace Violet、CFSE等) 标记T细胞，并在每个细胞分裂时在子细胞之间平均分配这一原理，我们可以相对容易地通过流式细胞术来追踪Treg细胞的活化增殖及其体外免疫抑制活性。

Keywords: 调节性T细胞 search CellTrace Violet标记 search 活化与增殖 search 体外免疫抑制功能 search

材料与试剂

一、小鼠淋巴结、脾脏单细胞悬液制备相关耗材及试剂

  1. 移液枪头
  2. 6 cm平皿 (NEST, catalog number: 110001)
  3. 15 ml聚丙烯离心管 (康宁, catalog number: 352096)，1.5 ml离心管 (国产)
  4. 200目白色尼龙网 (达科为, catalog number: DKW33-N25)
  5. 0.22 μm无菌滤膜 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
  6. 6至8周龄大小的C57/BL6，Foxp3-GFP KI品系小鼠
  7. 75%酒精
  8. 1x ACK红细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
    1)
    氯化铵 (NH4Cl)
    2)
    碳酸氢钾 (KHCO3)
    3)
    乙二胺四乙酸 (EDTA)
  9. 单细胞悬液 (见溶液配方)
    1)
    DMEM培养基 (Invitrogen, catalog number: C11965500CP)
    2)
    胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
    3)
    氨苄西林钠
    4)
    硫酸链霉素


二、富集CD4+ T细胞相关试剂与耗材

  1. EasysepTM磁铁 (Stem Cell, catalog number: 18000)
  2. Anti-CD8α mAb (克隆号：2.43，BioXcell, catalog number: BE0061)
  3. BioMag goat anti-Rat IgG beads (Qiagen, catalog number: 310107)
  4. BioMag goat anti-mouse IgG beads (Qiagen, catalog number: 310007)
  5. 1x PBS缓冲液 (见溶液配方)
    1)
    氯化钠 (NaCl)
    2)
    磷酸氢二钠 (Na2HPO4)
    3)
    磷酸二氢钠 (NaH2PO4)
    4)
    氯化钾 (KCl)
  6. 1x FACS缓冲液 (见溶液配方)
    1)
    牛血清白蛋白 (BSA)
    2)
    叠氮钠 (NaN3)


三、细胞分选相关试剂及耗材

  1. 5 ml流式管 (康宁, catalog number: 352054)
  2. CD4-PercP-Cy5.5 (克隆号：RM-5，eBioscience, catalog number: 45-0042-82)
  3. CD62L-APC (克隆号：MEL-14，Biolegend, catalog number: 104412)


四、Treg细胞培养相关试剂及耗材

  1. 96孔U底细胞培养板 (康宁, catalog number: 3799)
  2. Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation (Life Technology, catalog number: 11456D)
  3. 重组人IL-2细胞因子 (简称rIL-2，PeproTech, catalog number: AF-200-02)
  4. ICOS-APC (克隆号：7E.19G9，eBioscience, catalog number: 17-9942-82)
  5. CellTrace Violet增殖试剂盒 (Invitrogen, catalog number: C34557)
  6. Anti-mouse CD3 (克隆号：145-2C11，BioXcell, catalog number: BE0001-1)
  7. 1640 RPMI完全培养基 (见溶液配方)
    1)
    1640 RPMI培养基 (Invitrogen, catalog number: C22400500CP)
    2)
    胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
    3)
    100x NEAA (Gibco, catalog number: 11140-050)
    4)
    氨苄西林钠
    5)
    硫酸链霉素
  8. 流式荧光抗体 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 血球计数板以及盖玻片 (国产)
  2. 玻璃组织研磨片、金属筛网、研磨棒 (均为国产)
  3. 30~300 μl移液枪 (BRAND)
  4. 台式小型高速离心机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 75002430)
  5. 大型柜式离心机 (Kubota, catalog number: 5930)
  6. 立式压力蒸汽灭菌锅 (博讯)
  7. BD LSRFortessa 流式细胞分析仪 (5激光) (BD Bioscience, model: LSRFortessa)
  8. BD FACSAria III流式细胞分选仪 (BD Biosciences，FACSArial III)
  9. 旋转孵育器 (Kylin-Bell lab, model: QB-128)
  10. 二氧化碳细胞培养箱 (New Brunswick Scientific, model: Galaxy 170S)
  11. 生物显微镜 (重庆奥特光学仪器有限责任公司, model: B204LED)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：朱雪平, 周旭宇. (2019). Treg细胞功能的流式检测. Bio-101: e1010305. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010305.
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How to cite: Zhu X. P. and Zhou, X. Y. (2019). Functional Analysis of Mouse Tregs by Flow Cytometry Analysis. Bio-101: e1010305. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010305.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 动物模型 > 小鼠

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