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Treg细胞亚群的流式检测

Subset Analysis of Mouse Tregs by Flow Cytometry

朱 朱雪平*
周 周旭宇

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010304 浏览次数: 8209

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流式细胞术实验手册
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摘要：调节性T细胞 (简称Treg)，是一群具有免疫抑制功能的特殊CD4+ T细胞，对维持机体的免疫耐受及免疫稳态至关重要 (Sakaguchi，2004)。虽然Treg细胞都特异性表达转录因子Foxp3，但Treg也不是均一的细胞亚群。依据分化场所和前体细胞的不同，Treg细胞可以分为胸腺来源的tTreg的和外周诱导形成的pTreg，目前主要由Nrp-1和Helios这两个分子来区分tTreg和pTreg (Josefowicz和Rudensky，2009)。此外，依据其活化状态，Treg细胞可以分为CD44loCD62Lhi静息状态的Treg细胞 (简称“cTreg”) 以及CD44hiCD62Llo活化状态的效应Treg细胞 (简称“eTreg”)；cTreg高表达归巢受体CD62L以及趋化因子受体CCR7，主要存在于二级淋巴器官；相反，eTreg细胞会下调表达CD62L和CCR7，上调表达活化相关分子如CD44、ICOS、KLRG1、CTLA4、CD69等，主要定居于非淋巴器官组织中 (Smigiel等，2014)。eTreg细胞还可以进一步上调效应T细胞相关的转录因子如T-bet、GATA3、RoRγt以及Bcl6发育成特定的效应Treg细胞如Th1-Treg、Th2-Treg、Th17-Treg以及TFR，促使表达相应的趋化因子受体，来更好的发挥特定的免疫抑制功能 (Josefowicz等，2012；Cretney等，2013)。
       Treg细胞的成熟及发育缺陷是造成自身免疫性疾病的重要原因，因此分析其亚群分类对理解免疫稳态控制具有重要的意义 (Dominguez-Villar和Hafler，2018)。在此，依据Treg细胞表达表面及内部分子的差异，主要讲述如何运用流式细胞仪分析Treg细胞主要亚群分类。

Keywords: 调节性T细胞 (Treg) search 亚群分类 search 流式检测 search

材料与试剂

一、小鼠胸腺、淋巴结单细胞悬液制备相关耗材及试剂

  1. 移液枪头
  2. 6 cm平皿 (NEST, catalog number: 110001)
  3. 15 ml聚丙烯离心管 (康宁, catalog number: 352096)
  4. 1.5 ml离心管 (国产)
  5. 200目白色尼龙网 (达科为, catalog number: DKW33-N25)
  6. 5 ml流式管 (圆底无盖未灭菌，国产)
  7. 0.22 μm无菌滤膜 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
  8. 6至8周龄大小的Foxp3-GFP-hCre BAC转基因小鼠
  9. 75%酒精
  10. 1x ACK红细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
    1)
    氯化铵 (NH4Cl)
    2)
    碳酸氢钾 (KHCO3)
    3)
    乙二胺四乙酸 (EDTA)
  11. 单细胞悬液 (见溶液配方)
    1)
    DMEM培养基 (Invitrogen, catalog number: C11965500CP)
    2)
    胎牛血清 (FBS) (Bioind, catalog number: 04-001-1ACS)
    3)
    氨苄西林钠
    4)
    硫酸链霉素

二、流式检测试剂及抗体

  1. 流式检测相关试剂 
    1)
    1 x PBS缓冲液 (见溶液配方)
    氯化钠 (NaCl)
    磷酸氢二钠 (Na2HPO4)
    磷酸二氢钠 (NaH2PO4)
    氯化钾 (KCl)
    2)
    1x FACS缓冲液 (见溶液配方)
    牛血清白蛋白 (BSA)
    叠氮钠 (NaN3)
    3)
    4% PFA (多聚甲醛) 固定液 (工作浓度为1%) (见溶液配方)
    氢氧化钠 (NaOH)
    多聚甲醛粉末
  2. 细胞表面分子流式检测抗体 (见溶液配方)
    1)
    CD4-PercP-Cy5.5 (克隆号：RM-5，eBioscience, catalog number: 45-0042-82)
    2)
    CD8α-AF700 (克隆号：53-6.7，Biolegend, catalog number: 100730)
    3)
    Neuropilin-1-Biotin (R&D, catalog number: BAF566)
    4)
    Streptavidin-APC (Biolegend, catalog number: 405207)
    5)
    CD44-APC (克隆号：IM7，eBioscience, catalog number: 17-0441-83)
    6)
    CD62L-PE (克隆号：MEL-14，Biolegend, catalog number: 104408)
    7)
    ICOS-APC (克隆号：7E.17G9，eBioscience, catalog number: 17-9942-82)
    8)
    KLRG1-APC (克隆号：2F1，eBioscience, catalog number: 17-5893-82)
    9)
    CCR7-PE (克隆号：4B12，eBioscience, catalog number: 12-1971-82)
    10)
    CD25-PE (克隆号：PC61.5，eBioscience, catalog number: 12-0251-82)
    11)
    CXCR3-APC (克隆号：CXCR3-173，eBioscience, catalog number: 17-1831-82)
    12)
    CXCR5-APC (克隆号：2G8，BD Bioscience, catalog number: 560615)
  3. 细胞内部分子流式检测抗体
    1)
    Foxp3-BV421 (克隆号：FJK-16s, eBioscience, catalog number: 48-5773-82)
    2)
    Helios-PE (克隆号：22F6, Biolegend, catalog number: 137216)
    3)
    CTLA4-PE (克隆号：UC10-4B9, eBioscience, catalog number: 14-1522-82)
    4)
    Ki67-eF660 (克隆号：SolA15, eBioscience, catalog number: 50-5698-82)
    5)
    Bcl2-AF647 (克隆号：BCL/10C4，Biolegend, catalog number: 633510)
    6)
    T-bet-PE (克隆号：eBio4B10, eBioscience, catalog number: 12-5825-82)
    7)
    GATA3-PE (克隆号：TWAJ, eBioscience, catalog number: 12-9966-42)
    8)
    IRF4-eF660 (克隆号：3E4, eBioscience, catalog number: 50-9858-82)
    9)
    RoRγt-APC (克隆号：B2D, eBioscience, catalog number: 17-6981-82)
    10)
    Bcl6-PE (克隆号：GI191E, eBioscience, catalog number: 12-9887-80)
  4. Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 00-5523-00)
    该试剂盒所包含的试剂：
    1)
    固定/透化浓缩液 (Fixation/Permeabilization Concentrate)
    2)
    固定/透化稀释液(Fixation/Permeabilization Diluent)
    3)
    透化缓冲液 (10x Permeabilization Buffer，简称10x Perm，使用浓度为1x，用超纯水稀释即可)
  5. 转录因子T-bet染色相关试剂
    1)
    固定/透化缓冲液即BD Cytofix/Cytoperm buffer (BD Bioscience, catalog number: 554722)，1x Cytofix/Cytoperm缓冲液直接使用即可
    2)
    透化/清洗缓冲液即BD Perm/Wash buffer (BD Bioscience, catalog number: 554723)，10x BD Perm/Wash缓冲液用ddH2O稀释至1x即可使用

仪器设备

  1. 组织剪
  2. 手持移液枪
  3. 玻璃组织研磨片、金属筛网、研磨棒 (均为国产)
  4. 台式小型高速离心机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 75002430)
  5. 大型柜式离心机 (Kubota, catalog number: 5930)
  6. BD LSRFortessa流式细胞仪 (5激光) (BD Bioscience，LSRFortessa)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：朱雪平, 周旭宇. (2019). Treg细胞亚群的流式检测. Bio-101: e1010304. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010304.
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How to cite: Zhu X. P. and Zhou, X. Y. (2019). Subset Analysis of Mouse Tregs by Flow Cytometry. Bio-101: e1010304. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010304.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 动物模型 > 小鼠

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