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果蝇组织荧光原位杂交

Fluorescence in Situ Hybridization of Drosophila Tissues

刘 刘冀珑

发表时间: 2019年06月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010301 浏览次数: 6129

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果蝇实验手册
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摘要：荧光原位杂交用于RNA和DNA在组织和细胞中的定位，而免疫组织化学用于蛋白质的定位。传统的荧光原位杂交技术非常复杂，耗时，而且效果不稳定。本文结合作者十几年的果蝇研究经验，介绍一个快速高效的荧光原位杂交技术。该方法通过设计短的目标序列而定制合成的DNA作为模板，体外转录制备荧光标记的RNA探针。针对DNA和RNA目标采用不同的温度杂交，然后将样品放在杂交混合液直接制片在激光扫描共聚焦显微镜下直接观察。此外，结合免疫组织化学和荧光原位杂交可以同时观察蛋白质和核酸在组织及细胞中的分布和定位。

Keywords: 果蝇 search 原位杂交 search 荧光原位杂交 search 核酸与蛋白质定位分析 search

材料与试剂

  1. 移液枪头
  2. 培养皿
  3. 载玻片
  4. 盖玻片
  5. 500 μl离心管
  6. 雌性果蝇成虫
  7. Grace’s Insect Medium
  8. 4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, PFA)
  9. PBS (10×) (Beyotime, ST476)
  10. TritonTM X-100
  11. 20% Tween 20
  12. 马血清
  13. 一抗 (特异性结合目标蛋白)
  14. 二抗 (带有荧光基团，特异性结合一抗)
  15. DNA染料：DAPI或者Hoechst 33342
  16. 凡士林
  17. 指甲油
  18. C/A/GTP
  19. UTP
  20. Fluor-UTP (Alexa Fluor® 488-5-UTP, Alexa Fluor® 546-14-UTP或者BODIPY®-TR-14-UTP，产自Molecular ProbesTM)
  21. 5×转录缓冲液
  22. DEPC·H2O (酸二乙酯处理过的纯水)
  23. 模版DNA
  24. T3 RNA聚合酶
  25. 甲酰胺
  26. 20×盐水-柠檬酸钠缓冲液
  27. 肝素
  28. 酵母tRNA
  29. 柠檬酸
  30. 丙酮
  31. 原位混合液 (见溶液配方)
  32. 磷酸缓冲液 (1× PBS) (见溶液配方)
  33. PST (1×) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 镊子
  2. 解剖显微镜 (Olympus, SZ61)
  3. 移液器 (200 μl和20 μl)
  4. 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica Sp5II或SP8)
  5. 果蝇二氧化碳麻醉工作站

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：刘冀珑. (2019). 果蝇组织荧光原位杂交. Bio-101: e1010301. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010301.
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How to cite: Liu, J. L. (2019). Fluorescence in Situ Hybridization of Drosophila Tissues. Bio-101: e1010301. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010301.
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分类

细胞生物学 > 细胞染色

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