研究背景

       在拟南芥中，利用分子遗传学和基因组学的方法已经鉴定了乙烯信号通路的关键组分 (Guo and Ecker, 2004)。乙烯在水稻生长，发育和环境适应中发挥了重要作用，包括胚芽鞘和芽的伸长，通气组织的发育和耐淹反应 (Xu等, 2006; Fukao and Bailey-Serres, 2008; Ma等, 2010)。在水稻和拟南芥中，乙烯调节了不同的生物学过程，因此水稻可能具有独特的乙烯信号传导途径 (Yang等, 2015a)。正向遗传学对于充分揭示水稻乙烯信号通路的机制至关重要。因此，有必要建立一种筛选水稻乙烯反应突变体的有效方法。基于拟南芥 “三重反应”的遗传筛选已经得到了广泛的应用 (Johnson and Ecker, 1998; Stepanova and Ecker, 2000)。然而，由于水稻乙烯反应表型的未知性，水稻中的遗传筛选鲜有报道。
       黑暗中，乙烯促进水稻胚芽鞘的伸长生长 (Ku等, 1970)。在我们的实验条件下，乙烯促进水稻胚芽鞘的生长而抑制根的生长，我们称之为“双重反应”。在过去十年中，我们根据“双重反应”已经鉴定了一系列的水稻乙烯反应突变体。我们将其命名为maohuzi(mhz) (Ma等, 2013)。mhz7/OsEIN2突变体的胚芽鞘与根均对乙烯不敏感，而其过表达转基因株系表现为组成型的乙烯反应和过敏感表型 (Ma等, 2013)。MHZ6/OsEIL1与其同源基因OsEIL2分别调控水稻根与胚芽鞘的乙烯反应 (Yang等, 2015b)。MHZ4/OsABA4 (Ma等, 2014) 与MHZ5/OsCRTISO (Yin等, 2015) 的研究发现，在水稻中，乙烯抑制水稻根的生长需要ABA途径，这与拟南芥中是完全不同的。MHZ2/SOR1的研究揭示了SOR1-OsIAA26信号模块位于TIR/ABF2-auxin-OsIAA9信号的下游，特异性地调节水稻根乙烯反应的新机制 (Chen等, 2018)。MHZ3的研究表明，乙烯诱导的MHZ3可以与OsEIN2互作并稳定OsEIN2蛋白，从而维持乙烯反应 (Ma等, 2018)。本文中我们详细描述了水稻乙烯反应突变体的筛选及相关分析方法。该方案也可用于其他单子叶植物的乙烯反应筛选与鉴定 (Yang等, 2015a)。此外，通过该方法我们还鉴定到了具有长中胚轴的突变体gaoyao (gy1)，揭示了乙烯通过促进茉莉酸的合成从而抑制中胚轴和胚芽鞘伸长的机制 (Xiong等, 2017)。

材料与试剂

1. 注射器：2 ml，5 ml和60 ml
2. 培养皿 (康宁Corning, PYREX^®, catalog number: 3160-60)
3. 硅胶塞 (Laboran, catalog numbers: 9-860-03, 9-860-06, 9-860-09, 9-860-11等)
4. 密封塑料盒和杯子：
   
   1)

   5.5 L盒子 (乐扣乐扣, catalog number: HPL836) 与12孔的不锈钢筛子
   2)

   520 ml杯子 (乐扣乐扣, catalog number: HPL931N) 与不锈钢网
   注：盖上盖子以后杯子的容积是520 ml。
   3)

   20 L盒子 (FUDOGIKEN, catalog number: 112025) 与100孔的不锈钢筛子
   注：每个盒子的侧面有一孔，每个孔配有合适型号的硅胶塞；杯子的盖子上也配有合适型号的硅胶塞 (图1)。
5. 植物种子：野生型，突变体或者转基因种子
6. 乙烯气体
7. 1-甲基环丙烯 (1-MCP) (绿诺生物科技, Maxfresh)
   
   
   图1. 密封塑料盒与杯子。 每个容器都配备有合适型号的硅胶塞以便注入乙烯气体。
   

仪器设备

1. 烧杯 (BOMEX, 250 ml或者500 ml, 可根据种子的多少选择合适的烧杯)
2. 弱的绿光光源 (普通的市售绿光灯即可)
3. 不锈钢筛子和不锈钢网：
   
   1)

   12孔筛子(240 mm长 x 180 mm宽 x 33 mm高) 可用于乙烯反应表型分析。
   2)

   直径62 mm的不锈钢网与100孔的筛子(400 mm长 x 300 mm宽 x 33 mm高) 可用于突变体的筛选、阳性苗的筛选以及图位克隆材料的处理与筛选。
   注：每个筛子的四角各有一个高29 mm腿 (图2)。
4. 可以密闭的瓶子：300 ml与1,000 ml的容量
5. 培养箱 (可以设置28 °C与37 °C)
6. 烘箱
7. 喷壶
   
   
   图2. 12孔筛子、100孔筛子与不锈钢网。A. 筛子的侧面图；B. 筛子的俯视图； C. 直径62 mm的不锈钢网。
   

实验步骤