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果蝇细胞周期检验点检测–EdU法、BrdU法及p-H3抗体法

Detection of Cell Cycle Checkpoint in Drosophila by EdU Assay, BrdU Assay and Anti-Phosphorylated Histone 3 Antibody Staining

王 王清华*
徐 徐起*
秘 秘晓林

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年06月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010293 浏览次数: 7202

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果蝇实验手册
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摘要：细胞周期指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，细胞周期进程中存在多个检验点。在G1期和S期之间存在DNA合成起始转换点，简称S期检验点；在G2期和M期之间存在有丝分裂诱导转换点，简称G2/M检验点。检测S期检验点通常采用BrdU或EdU方法。BrdU (5-Bromo-2ʹ-Deoxyuridine) 全称5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷，EdU(5-Ethynyl-2ʹ-Deoxyuridine) 全称5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷，它们均为胸腺嘧啶类似物，能够在S期替代胸腺嘧啶 (T) 掺入正在复制的DNA中。BrdU可以使用抗BrdU单克隆抗体检测，EdU通过与分子染料的共轭结合，高效、快速检测细胞中的DNA复制。在有丝分裂期组蛋白3-H3Ser10被磷酸化修饰，这是细胞有丝分裂进程中的特征性事件。检测G2/M检验点通常使用抗磷酸化组蛋白3-H3Ser10抗体 (p-H3) 免疫染色方法，通过对阳性细胞进行计数，分析细胞是否进行了正常的有丝分裂。本文将依次对上述方法进行介绍。

Keywords: S期检验点 search G2/M检验点 search BrdU search EdU search p-H3 search


方法1：EdU法检测果蝇幼虫眼成虫盘S期检验点
  

摘要：使用EdU法检测果蝇幼虫眼成虫盘中的S期检验点 (Daul等，2010；Song等，2018)。

材料与试剂

  1. 盖玻片(22 × 22 mm)
  2. 标准级显微镜载载玻片(25 × 75 mm，厚度1 mm ± 0.2 mm)
  3. 解剖皿
  4. 1.5 ml离心管
  5. 果蝇三期幼虫
  6. 羟基脲 (Hydroxyurea, HU)
  7. 果蝇食物
  8. 1× PBS
  9. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787)
  10. 1× Click reaction buffer
  11.  CuSO4
  12. Alexa Fluorazide
  13. Reaction buffer additive
  14. SFX-Insect培养液 (HyClone, catalog number: SH30278.02) (4 °C保存)
  15. Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit (Invitrogen, catalog number: C10337) (4 °C保存) (见溶液配方)
  16. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128) (-20 °C保存)
  17. 指甲油
  18. 0.5% PBST (见溶液配方)
  19. 3% BSA (见溶液配方)
  20. 3.7%甲醛 (新鲜配制) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 解剖镊
  2. 解剖显微镜 (奥林帕斯，model: SZ51)
  3. 转移脱色摇床 (奥豪斯，model: TS-8)
  4. 共聚焦显微镜 (徕卡，model: TCS SP5) 或正置荧光显微镜 (蔡司，model: Imager Z2)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王清华, 徐起, 秘晓林. (2019). 果蝇细胞周期检验点检测–EdU法、BrdU法及p-H3抗体法. Bio-101: e1010293. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010293.
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How to cite: Wang, Q. H., Xu, Q. and Bi, X. L. (2019). Detection of Cell Cycle Checkpoint in Drosophila by EdU Assay, BrdU Assay and Anti-Phosphorylated Histone 3 Antibody Staining. Bio-101: e1010293. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010293.
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分类

细胞生物学 > 细胞染色

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