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果蝇成蝇大脑的解剖与免疫组化
Anatomy and Immunochemistry of the Whole-mount Brain of Adult Drosophila
发表时间: 2019年06月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010265 浏览次数: 10601
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实验原理：在神经科学研究中，果蝇作为一种应用超过百年模式生物，占据了不可取代的地位。由于其神经元较为简单且具有遗传可控性，果蝇适合在基因水平、细胞水平以及神经环路水平上开展对神经发育、神经网络功能等研究和分析 (Kazama等，2015)，对于分析行为的遗传调控尤其具有宝贵价值 (Sun等，2017)。
免疫荧光组织化学是利用免疫学中抗原与抗体结合的原理以及组织化学技术对细胞或组织特定抗原或抗体进行定位和定量研究的技术，具有高度特异性和精确性 (吕国蔚和李云庆，2011)。由于组织或细胞中所进行的抗原抗体反应在一般条件下是不可见的，所以需要使用荧光染料作为标记物，首先将已知的抗原或抗体上标记好荧光素，并将它作为探针检测细胞或组织中相应的抗原或抗体，同时发生抗原抗体反应形成带有特定荧光素的复合物，在特定波长激光的照射下产生不同颜色的荧光 (吕国蔚和李云庆，2011)，从而看到荧光标记的细胞组织的形态及位置。同时可以基于标准的免疫荧光组织化学染色步骤并做出改良，将不同抗体和实验组织或器官混合孵育，在激光扫描共聚焦显微镜下可以观察到不同荧光素在荧光显微镜不同波长的激光照射下产生的不同颜色的荧光，这既可以实现对神经细胞精细结构的可视化，又可以显示神经元、纤维、终末内之间的相互关系 (Wu和Luo，2006)。该方法简单、易于操作，具有较高的灵敏性和精确性，是神经科学研究中不可或缺的一种方法。
而绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein, GFP) (Misteli和Spector，1997) 的遗传标记与免疫荧光染色的共用是果蝇神经科学的研究中不可或缺的一种手段。由于GFP在波长为488 nm的激光照射下会吸收部分能量从而产生绿色的荧光，利用这一特性，可将GFP用作荧光报告基因。利用分子生物学手段，将GFP作为报告基因表达在UAS的下游，同时利用果蝇中的UAS-Gal4二元表达系统，使得GFP能够标记特定神经细胞。同时使用免疫荧光染色的手段，不仅可以确定某个蛋白是否在特定神经细胞中表达，还可以确定特定神经细胞的细胞类型，更能够鉴定特定神经元的递质能类型。本文共同使用GFP遗传标记技术与免疫组化技术，对特定神经细胞进行了细胞类型的鉴定。
实验目的：成蝇脑部的解剖；免疫荧光组织化学染色技术与GFP遗传标记的共用。
免疫荧光组织化学是利用免疫学中抗原与抗体结合的原理以及组织化学技术对细胞或组织特定抗原或抗体进行定位和定量研究的技术，具有高度特异性和精确性 (吕国蔚和李云庆，2011)。由于组织或细胞中所进行的抗原抗体反应在一般条件下是不可见的，所以需要使用荧光染料作为标记物，首先将已知的抗原或抗体上标记好荧光素，并将它作为探针检测细胞或组织中相应的抗原或抗体，同时发生抗原抗体反应形成带有特定荧光素的复合物，在特定波长激光的照射下产生不同颜色的荧光 (吕国蔚和李云庆，2011)，从而看到荧光标记的细胞组织的形态及位置。同时可以基于标准的免疫荧光组织化学染色步骤并做出改良，将不同抗体和实验组织或器官混合孵育，在激光扫描共聚焦显微镜下可以观察到不同荧光素在荧光显微镜不同波长的激光照射下产生的不同颜色的荧光，这既可以实现对神经细胞精细结构的可视化，又可以显示神经元、纤维、终末内之间的相互关系 (Wu和Luo，2006)。该方法简单、易于操作，具有较高的灵敏性和精确性，是神经科学研究中不可或缺的一种方法。
而绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein, GFP) (Misteli和Spector，1997) 的遗传标记与免疫荧光染色的共用是果蝇神经科学的研究中不可或缺的一种手段。由于GFP在波长为488 nm的激光照射下会吸收部分能量从而产生绿色的荧光，利用这一特性，可将GFP用作荧光报告基因。利用分子生物学手段，将GFP作为报告基因表达在UAS的下游，同时利用果蝇中的UAS-Gal4二元表达系统，使得GFP能够标记特定神经细胞。同时使用免疫荧光染色的手段，不仅可以确定某个蛋白是否在特定神经细胞中表达，还可以确定特定神经细胞的细胞类型，更能够鉴定特定神经元的递质能类型。本文共同使用GFP遗传标记技术与免疫组化技术，对特定神经细胞进行了细胞类型的鉴定。
实验目的：成蝇脑部的解剖；免疫荧光组织化学染色技术与GFP遗传标记的共用。
材料与试剂
- 圆形贴纸 (AVERY, 1000 Labels White, 5720TM)
- 载玻片 (江帆牌, catalog number: 7105)
- 盖玻片 (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 72200-10)
- 0.6 ml EP管 (Axygen, catalog number: MCT-060-C)
- 培养皿 (北京瑞艾正特生物科技有限公司，一次性使用塑料培养皿)
- 果蝇基因型为86E01-Gal4/UAS-GFP
- Triton X-100 (Solarbio, catalog numbers: 9002-93-1 and T8200)
- 封片液 (Vector, Vectashield Mounting Medium For Fluorescence, catalog number: ZD1002C)
- 8%多聚甲醛 (Paraformaldehyde，PFA) (Electron Microscopy Science, catalog number: 157-8)
- Normal Goat Serum (NGS) (Nordic-MUbio)
- Mouse-anti-repo (Developmental Studies Hybridoma Bank, 8D12 anti-Repo-s)
- Alexa FluorTM 555 goat anti-mouse IgG (Life technologies, catalog number: A21422)
- 酒精 (山东利尔康医疗科技股份有限公司，利尔康®75%酒精消毒液)
- 指甲油 (品派, catalog number: 29269705379-E049)
- 20× PBS缓冲液 (生工®Sangon Biotech, catalog number: B548117-0500)
- 0.3% PBST溶液 (见溶液配方)
- 固定液 (4% PFA) (见溶液配方)
- 封闭液 (5% NGS) (见溶液配方)
- 一抗溶液 (见溶液配方)
- 二抗溶液 (见溶液配方)
仪器设备
- 镊子 (Dumostar, catalog number: 0209-5-PO)
- 体视显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司，SMA-B4连续变倍体视显微镜)
- 激光扫描共聚焦显微镜 (Nikon A1)
- 摇床 (其林贝尔仪器制造有限公司, model: Transference Decoloring Shaker TS-8)
实验步骤
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：杨扬, 周鸣敏, 李岩. (2019). 果蝇成蝇大脑的解剖与免疫组化. Bio-101: e1010265. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010265.
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How to cite: Yang,
Y., Zhou, M. M. and Li, Y. (2019). Anatomy and Immunochemistry of the Whole-mount Brain of Adult Drosophila. Bio-101: e1010265. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010265.
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分类
神经科学 > 神经解剖学和神经环路
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