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果蝇翅成虫盘RNA原位杂交技术

RNA in situ Hybridization in Drosophila Wing Imaginal Discs

张 张延松*
刘 刘敏*
朱 朱健

*Contributed equally to this work 发表时间: 2019年06月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010261 浏览次数: 4998

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果蝇实验手册
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摘要：原位杂交 (in situ hybridization) 是指利用单链核酸分子之间互补碱基配对的原理，将带有标记的核酸探针与组织内核酸杂交成稳定的杂交双链核苷酸。经过显色反应，通过光学显微镜或电子显微镜可以对细胞内mRNA、tRNA和rRNA等RNA分子的存在与定位进行检查。原位杂交可以使用DNA或者RNA探针，本实验介绍使用RNA探针对果蝇翅成虫盘组织mRNA的原位杂交。

Keywords: 果蝇 search 翅成虫盘 search 原位杂交 search

材料与试剂

  1.  移液枪头
  2. 1.5 ml塑料离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
  3.  果蝇三龄幼虫
  4. VectorRed AP substrate Kit (Maravai LifeSciences, Vector Laboratories, SK-5100)
  5. NBT/BCIP (Thermo Fisher Scientific, catalog numbers: LA01, LA02)
  6. 抗地高辛碱性磷酸酶抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
  7. 抗地高辛辣根过氧化氢酶抗体 (Roche, catalog number: 1207733)
  8. PBS缓冲液 (Coolaber, catalog number: PM272215100)
  9. 吐温-20 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 30189380)
  10. 甲酰胺 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0314-500ML)
  11. 20× SSC (Solarbio, catalog number: S1035)
  12. 肝素 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S9276)
  13. 鲑鱼精子DNA (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D1626)
  14. 氯化钠 (NaCl2, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S7653)
  15. 六水合氯化镁 (MgCl2•6H2O, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: M2393)
  16. 左旋咪唑 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: L9756)
  17. 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 (1 M Tris-HCl pH 8.8, Solarbio, catalog number: T1010)
  18. 4%多聚甲醛 (Paraformaldehyde, PFA) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 441244)
  19. 醋酸铵 (NH4OAc, Merck, Sigma-Aldrich, 631-61-8)
  20. 乙醇 (CH3CH2OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: E7148)
  21. 甲醇 (CH3OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 67-56-1)
  22. DEPC (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D5758)
  23. 转录缓冲液 (Transcription buffer, Roche, catalog number: 11465384001)
  24. 地高辛RNA标记混合液 (DIG RNA Labeling Mix, Roche, catalog number: 11277073910)
  25. T7 RNA聚合酶 (T7 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10881767001)
  26. SP6 RNA聚合酶 (SP6 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10810274001)
  27. RNA酶抑制剂 (RNAase inhibitor, Roche, catalog number: 3335399001)
  28. 碳酸钠 (Na2CO3, Merck, Sigma-Aldrich, 497-19-8)
  29. 碳酸氢钠 (Na2HCO3, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: Q0380)
  30. 醋酸钠 (NaOAc, Merck, Sigma-Aldrich, 6131-90-4)
  31. 氯化锂 (LiCl, Merck, Sigma-Aldrich, 7447-41-8)
  32. 转运RNA (tRNA, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: A5253-500G)
  33. PBSTw溶液 (见溶液配方)
  34. Hyb B (见溶液配方)
  35. Hyb A (见溶液配方)
  36. 碱性磷酸酶染色溶液 (见溶液配方)
  37. DEPC水 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器 (Gilson, models: P2-P1000)
  2. -80 °C超低温冰箱 (Esco, Lexicon, model: UUS-668B-1)
  3. 4 °C及-20 °C冰箱 (Haier, model: BCD-539WT)
  4. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, model: ISOTEMP 202)
  5. 摇床 (杭州米欧，model: RH-24)
  6. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5415D)
  7. 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica, model: TCS SP8)
  8. 电子天平 (Mettler Toledo, model: PL602-S)

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：张延松, 刘敏, 朱健. (2019). 果蝇翅成虫盘RNA原位杂交技术. Bio-101: e1010261. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010261.
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How to cite: Zhang, Y. S., Liu, M. and Zhu, A. J. (2019). RNA in situ Hybridization in Drosophila Wing Imaginal Discs. Bio-101: e1010261. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010261.
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分类

分子生物学 > RNA

细胞生物学 > 细胞工程

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