材料与试剂

一、实验器具

1. 一次性耗材
   离心管50 ml, 10 ml, 1.5 ml
   一次性枪头1,000 μl, 200 μl, 100 μl, 10 μl
   封口膜或保鲜膜
   小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
   指甲油
   铝箔纸
2. 孵育器皿
   1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
3. 解剖器具
   
   1)

   解剖用塑料培养皿 (直径55 mm)：其底部要铺一层胶 (Dow Corning, Sylgard^® 184)，这样可避免镊子尖碰到底部时被弄弯
   2)

   培烧皿 (直径约4 cm带有磨口的盖子)：内装少量脱脂棉，并倒入少许75%的酒精。在解剖时当镊子尖端附着组织时，可以轻轻把镊子在酒精棉上擦拭，把镊子尖端的组织去掉
4. 玻片：20 mm × 40 mm，厚度小于20 μm
   玻片首先用浓硫酸浸泡过夜，用大量去离子水清洗，再用RNase free水冲洗3遍，放在脱色架上，60 °C烘干，用锡箔纸包好，室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半，即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份，即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片
   

1. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
2. Glycerol
3. KCl
4. Na₂HPO₄•12H₂O
5. KH₂PO₄
6. NaOH
7. 多聚甲醛 (Paraformaldehyde) (北京益利精细化学品有限公司)
8. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
9. Triton X-100 (ICN Biomedicals, catalog number: 58404)
10. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec BP 0042)
11. Ficoll^TM (华美Sino-American Biotec BIO 322)
12. PVP (华美Sino-American Biotec BR 2205)
13. NaCl (北京精细化工有限公司)
14. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
15. HCl
16. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
17. Torula RNA (Type IX) (Sigma, catalog number: R3629)
18. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
19. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
20. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
21. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
22. DMF (Dimethylformamide, 二甲基甲酰胺) (防化学院化工厂)
23. NBT (硝基四氮唑蓝) (Amresco, catalog number: E1181)
24. BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) (Amresco, catalog number: E1041)
25. EDTA (Amresco, catalog number: 0322, MW = 292.25)
26. Tris (Amresco, catalog number: 0497, MW = 121.14)
27. RNase A (BBI, catalog number: RB0473)
28. 封闭剂 (Blocking Reagent) (Roche, catalog number: 11096176001)
29. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
30. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司)
31. RNase free水 (见溶液配方)
32. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
33. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
34. PTw (见溶液配方)
35. PTX (见溶液配方)
36. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
37. 1 M Tris (见溶液配方)
38. 50× Denhardt’s Solution (100 ml) (见溶液配方)
39. 20× SSC (pH = 7.0) (见溶液配方)
40. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
41. RNase A储存液 (BBI, catalog number: RB0473) (见溶液配方)
42. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配) (见溶液配方)
43. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
44. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
45. Anti-Dig-AP抗体溶液 (见溶液配方)
46. NBT/BCIP显色剂 (见溶液配方)
47. 甘油溶液 (见溶液配方)

仪器设备

注：所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理。具体操作：洗净烘干后用锡箔纸封口，180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗，然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

1. 玻璃器皿
   量筒1,000 ml，100 ml，50 ml，25 ml，10 ml
   烧杯1,000 ml，400 ml，250 ml，200 ml，100 ml，50 ml
   细口瓶1,000 ml
   称量 20 ml
   玻璃棒
   蓝口瓶
2. 镊子：DUMONT #5一把；DUMONT #55一把
3. 样品勺：是取果蝇脑样本的关键，一般用直径0.5 mm铂金丝制作而成 (普通的不锈钢和铜丝易生锈影响实验，而且这些材料质地不够细密，易粘果蝇的组织)
4. MilliQ纯水仪 (Millipore)
5. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
6. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
7. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
8. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII) 
9. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
10. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
11. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168，需要配20倍的目镜)
12. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
13. 多道计时器
14. Leica DM 2500显微镜
15. 移液器
16. 冰箱 (4 °C和-20 °C)
17. 加热器
18. 电磁炉

实验步骤