材料与试剂

一、一次性耗材

1. 离心管50 ml，10 ml
2. 一次性枪头1,000 μl，200 μl，100 μl，10 μl
3. 一次性吸管，容量为3 ml
4. 15 cm培养皿
5. 软毛笔
6. 尼龙网
7. 纱网
8. 小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
9. 铝箔纸
10. 1.5 ml离心管
11. 玻片：20 mm × 40 mm，厚度小于20 μm
    玻片首先用浓硫酸浸泡过夜，用大量去离子水清洗，再用RNase free水冲洗3遍，放在脱色架上，60 °C烘干，用锡箔纸包好，室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半，即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份，即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片。
    

1. 指甲油
2. 显色剂 (BM Purple) (Roche, catalog number: 11442074001)，直接使用
3. 无水乙醇
4. 正庚烷 (heptane)
5. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
6. Paraformaldehyde (北京益利精细化学品有限公司)
7. NaCl (北京精细化工有限公司)
8. Triton X-100
9. 次氯酸钠溶液
10. KCl
11. Na₂HPO₄•12H₂O
12. KH₂PO₄
13. NaOH
14. 无水甲醇
15. Sucrose (北京益利精细化学品有限公司)
16. Agar (石狮市环球琼胶工业有限公司)
17. Apple Juice (汇源100%苹果汁)
18. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
19. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec, BP 0042)
20. Ficoll^TM (华美Sino-American Biotec, BIO 322)
21. PVP (华美Sino-American Biotec, BR 2205)
22. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
23. HCl
24. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
25. Torula RNA, Type IX (Sigma, catalog number: R3629)
26. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
27. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
28. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
29. MgCl₂
30. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
31. Maleic Acid (ACROS, catalog number: 110-16-7, MW = 116.07)
32. EGTA (Amresco, catalog number: 0732) 
33. EDTA (Amresco, catalog number: 0322) 
34. Tris (Amresco, catalog number: 0497)
35. Proteinase K (Amresco, catalog number: 0706) 
36. 0.1 M三乙醇胺 (Triethanolamine) (上海生工, catalog number: TT0776, MW = 149.9) 
37. 乙酸酐 (Acctic anhydride) (属于毒品原料，需要经特殊部门批准方可购买)
38. 多聚甲醛（Paraformaldehyde，北京益利精细化学品有限公司）
39. RNase A (BBI, catalog number: RB0473) 
40. 封闭剂, Blocking Reagent (Roche, catalog number: 11096176001)
41. 羊血清原液 (中杉金桥ZL1-9021)
42. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
43. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司) 
44. RNase free水 (见溶液配方)
45. 甲醛固定液 (终浓度为8%) (见溶液配方)
46. 胚胎洗液 (见溶液配方)
47. 漂白液 (见溶液配方)
48. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
49. PTw (见溶液配方)
50. 0.5 M EGTA (见溶液配方)
51. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
52. 1 M Tris (见溶液配方)
53. Proteinase K (见溶液配方)
54. 0.1 M三乙醇胺 (Triethanolamine) 溶液 (见溶液配方)
55. 乙酸酐 (Acctic anhydride) (见溶液配方)
56. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
57. 50× Denhardt’s Solution (见溶液配方)
58. 20× SSC (见溶液配方)
59. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
60. RNase A 储存液(见溶液配方)
61. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (见溶液配方)
62. 5× MAB (Maleic Acid Buffer, pH = 7.5) (见溶液配方)
63. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
64. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
65. Anti-Dig-AP抗体溶液(见溶液配方)
66. 甘油溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 玻璃器皿
   量筒1,000 ml，500 ml，250 ml，100 ml，50 ml，25 ml，10 ml
   烧杯1,000 ml，500 ml，400 ml，250 ml，200 ml，100 ml，50 ml
   细口瓶1,000 ml
   称量瓶20 ml
   玻璃棒
   蓝口瓶
2. 孵育器皿
   容量为4 ml的带密闭瓶盖的玻璃小瓶
3. 镊子

注：所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理，具体操作：洗净烘干后用锡箔纸封口，180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗，然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

4. 多道计时器
5. MilliQ纯水仪 (Millipore)
6. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
7. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
8. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
9. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII)
10. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
11. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
12. 摇床 (Heidolph, model: Polymax 1040)
13. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168，需要配20倍的目镜)
14. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
15. Leica DM 2500显微镜
16. 微波炉
17. 通风橱
18. -20 °C冰箱
19. 移液器
20. 37 °C烘箱
21. 电磁炉

实验步骤