Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

PCR扩增及克隆基因

PCR Amplification and Gene Cloning

徐 徐远涛
徐 徐强

发表时间: 2018年06月12日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010202 浏览次数: 15151

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实验原理：PCR (polymerase chain reaction) 的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3'端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性-退火-延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量呈指数级增加。PCR之后通过胶回收得到纯化的目的基因片段，连接到克隆载体质粒中，转入大肠杆菌细胞，质粒随着大肠杆菌细胞的快速繁殖也快速复制，富集大肠杆菌细胞抽提质粒即可得到大量的克隆质粒。
实验目的：通过PCR扩增目的基因片段，并利用大肠杆菌转化获得单克隆质粒，用于测序、基因序列分析、特异探针构建及后续表达载体构建。

Keywords: PCR search 大肠杆菌 search 转化 search 克隆 search 质粒 search

材料与试剂

  1. 各种型号枪头
  2. 离心管
  3. PCR用八连管
  4. 矿物油
  5. 封口膜
  6. 玻璃涂布棒
  7. DNA模板 (或cDNA)
  8. DNA聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase, 诺唯赞, catalog number: P505-d1)
  9. dNTP
  10. 引物
  11. 双蒸水
  12. Gene Ruler (Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb DNA ladder, catalog number: SM0311)
  13. 琼脂糖
  14. 核酸染料 (GelRed)
  15. 冰醋酸
  16. NaCl
  17. 胰蛋白胨
  18. 酵母提取物
  19. 琼脂粉
  20. 琼脂糖胶纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit, OMEGA, catalog number: D2500-02)
  21. 克隆质粒 (Zero-Background P-Topo-Blunt Simple Cloning Kit, Aidlab, catalog number: CV17)
  22. Trans 5α E. coli感受态细胞 (全式金生物科技有限公司)
  23. 质粒提取试剂盒 (AxyPrep Plasmid Kit, AXYGEN, catalog number: 21515KA1)
  24. TAE缓冲液 (见溶液配方)
  25. 氨苄霉素 (见溶液配方)
  26. LB培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 涡旋仪
  2. 小离心机
  3. PCR仪
  4. 电泳仪
  5. 凝胶成像系统
  6. 切胶仪
  7. 离心机 (配备1.5 ml转头)
  8. 恒温水浴锅
  9. 恒温摇床
  10. 恒温培养箱
  11. 酒精灯
  12. 制胶槽
  13. 梳子
  14. 手术刀
  15. 超净工作台
  16. 细胞培养平板

实验步骤

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：徐远涛, 徐强. (2018). PCR扩增及克隆基因. Bio-101: e1010202. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010202.
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How to cite: Xu, Y. T. and Xu, Q. (2018). PCR Amplification and Gene Cloning. Bio-101: e1010202. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010202.
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分类

分子生物学 > DNA > DNA 克隆

分子生物学 > DNA > PCR

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