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PEG法介导的柑橘原生质体转化

PEG-mediated Citrus Protoplast Transformation

杨 杨雯惠 *
刘 刘丹 *
郭 郭文武

*Contributed equally to this work 发表时间: 2018年06月12日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010187 浏览次数: 11935

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实验原理和目的：原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。由于消除了细胞壁的障碍，故原生质体是遗传操作、基因转化的好材料。以植物原生质体为材料进行遗传转化，可以瞬间表达外源基因，也可以获得外源基因稳定表达的转基因细胞系或转基因植株，此方法将外源基因转入之后从单个细胞发育，中途没有外源。常用的进行原生质体遗传转化的方法有电击法和PEG介导的转化法。电击法利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使外源基因穿过细胞膜而进入细胞中。这种方法操作简单，转化效率高，但是需要电击仪。PEG (聚乙二醇) 介导的转化方法是通过PEG处理改变细胞膜的通透性，从而使外源DNA易于进入原生质体。此方法不需要特殊的仪器设备，实验结果比较稳 定。本实验主要是从PEG介导的方法展开。原生质体可以从悬浮培养的细胞分离，也可以由新鲜叶片分离制备，然后进行遗传转化。

Keywords: 原生质体 search PEG search 遗传转化 search

材料与试剂

注：本实验中叶片及愈伤的准备，原生质体的分离、纯化、活体检查操作步骤所需试剂见柑橘原生质体融合-电融合 (刘丹等，2018)。

  1. 枪头
  2. 灭过菌的瓶子
  3. 离心管
  4. 吸水纸
  5. 真空管
  6. 真空源
  7. 1.5 ml微量离心管
  8. 圆底螺旋盖离心管
  9. 培养皿
  10. 抗生素
  11. LB
  12. RNase A溶液
  13. Buffer P1
  14. RNA酶A
  15. 缓冲液P2
  16. 缓冲液BB
  17. LyseBlue
  18. BH3营养液
  19. 葡萄糖
  20. 二甲基亚砜 (DMSO)
  21. NaOH
  22. PEG8000 MW (储备液，50%) (见溶液配方)
  23. 40% (w/v) 聚乙二醇 (PEG) 工作溶液 (见溶液配方)
  24. 洗脱溶液 (见溶液配方)

仪器设备

注：本实验中叶片及愈伤的准备，原生质体的分离、纯化、活体检查操作步骤所需设备见柑橘原生质体融合-电融合 (刘丹等，2018)。

  1. 移液枪
  2. 摇床
  3. 离心机
  4. CompactPrep Midi色谱柱
  5. 倒置荧光显微镜

实验步骤

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：杨雯惠 , 刘丹 , 郭文武 . (2018). PEG法介导的柑橘原生质体转化. Bio-101: e1010187. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010187.
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How to cite: Yang, W. H., Liu, D. and Guo, W. W. (2018). PEG-mediated Citrus Protoplast Transformation. Bio-101: e1010187. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010187.
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分类

细胞生物学 > 细胞分离和培养 > 转化

植物科学 > 植物细胞生物学 > 细胞分离

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