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农杆菌介导的籼稻遗传转化

Agrobacterium-mediated Transformation of Indica Rice

刘 刘瑜
凌 凌飞
林拥军 林拥军
陈 陈浩

发表时间: 2018年05月10日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175 浏览次数: 7696

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实验原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在一定条件下趋化性地感染植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，它们都含有一段可转移的DNA(T-DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口，可以将T-DNA插入到植物基因组中，并且稳定的遗传给后代。本实验是把目的基因装载到经过改造的Ti质粒的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向水稻愈伤的转移与整合，然后通过组织培养技术，再生出转化植株。
实验目的：通过农杆菌介导的遗传转化把目的基因导入到籼稻品种中(MH63，ZS97，9311等)。

Keywords: 籼稻 search 根癌农杆菌 search 遗传转化 search

材料与试剂

  1. 吸水纸
  2. 滤纸
  3. 大培养皿
  4. 小培养皿
  5. 封口膜
  6. Parafilm
  7. 接种环
  8. 籼稻种子
  9. EHA105农杆菌 (携带含目的基因载体)
  10. 乙醇
  11. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)
  12. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)
  13. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)
  14. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)
  15. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)
  16. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
  17. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)
  18. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC., catalog number: CDJ469)
  19. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)
  20. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
  21. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)
  22. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
  23. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
  24. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)
  25. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)
  26. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
  27. Proline
  28. Sucrose
  29. Agar powder
  30. D-sorbitol
  31. NH4NO3
  32. KNO3
  33. KH2PO4
  34. MgSO4∙7H2O
  35. CaCl2
  36. CaCl2∙2H2O
  37. MnSO4∙4H2O
  38. ZnSO4∙7H2O
  39. H3BO3
  40. KI
  41. Na2MoO4∙2H2O
  42. CoCl2∙6H2O
  43. CuSO4∙5H2O
  44. (NH4)2SO4
  45. FeSO4∙7H2O
  46. Na2 EDTA∙2H2O
  47. Glycine
  48. KOH
  49. HgCl2
  50. Glucose
  51. MSmax储备液(10x) (见溶液配方)
  52. MSmin储备液(100x) (见溶液配方)
  53. N6max储备液(10x) (见溶液配方)
  54. N6min储备液(100x) (见溶液配方)
  55. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
  56. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
  57. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  58. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  59. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  60. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  61. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  62. 200 mM AS储备液(见溶液配方)
  63. 1 N KOH储备液(见溶液配方)
  64. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)
  65. 50%葡萄糖(见溶液配方)
  66. 250 mg/ml CN (见溶液配方)
  67. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)
  68. 诱导培养基(见溶液配方)
  69. 继代培养基(见溶液配方)
  70. 预培养基(见溶液配方)
  71. 悬浮培养基(见溶液配方)
  72. 共培养基(见溶液配方)
  73. 筛选培养基(见溶液配方)
  74. 预分化培养基(见溶液配方)
  75. 分化培养基(见溶液配方)
  76. 生根培养基(见溶液配方)
    注：以上所有常规试剂都是由国药化工和光复科技提供。

仪器设备

  1. 超净工作台
  2. 100 ml三角瓶
  3. 250 ml三角瓶
  4. 500 ml三角瓶
  5. 生根管
  6. 剪刀
  7. 镊子
  8. 小铁勺
  9. 酒精灯
  10. 28 °C摇床
  11. 19 °C培养箱

实验步骤

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：刘瑜, 凌飞, 林拥军, 陈浩. (2018). 农杆菌介导的籼稻遗传转化. Bio-101: e1010175. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175.
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How to cite: Liu, Y., Ling, F., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated Transformation of Indica Rice. Bio-101: e1010175. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175.
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分类

植物科学 > 植物转化 > 农杆菌介导的转化方法

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