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根癌农杆菌介导的粳稻遗传转化

Agrobacterium-mediated Genetic Transformation of Japonica Rice

陈 陈秋红
陈 陈太钰
林拥军 林拥军
陈 陈浩

发表时间: 2018年05月10日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010174 浏览次数: 8186

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实验原理：根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在一定条件下趋化性地感染植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段可转移的DNA（T-DNA）。根癌农杆菌侵染植物细胞后，可将其T-DNA转移并插入到植物细胞的基因组中，并稳定地遗传给植物细胞后代。经过人工改造的Ti质粒可以作为基因工程载体，将目的基因导入受体植物中。本试验借助根癌农杆菌侵染，将外源基因导入水稻愈伤组织细胞，然后通过组织培养技术使被转化的水稻愈伤组织细胞分化再生，从而获得转基因水稻植株。整个试验过程需要4~5个月时间。
实验目的：将目的基因稳定地转化到粳稻品种(中花11，日本晴等)中表达，从而进行基因功能研究或者改良农艺性状。

Keywords: 粳稻 search 根癌农杆菌介导 search 遗传转化 search

材料与试剂

  1. 吸水纸
  2. 滤纸
  3. 无菌大平皿
  4. 无菌小平皿
  5. 粳稻种子
  6. 根癌农杆菌工程菌株EHA105 (携带含目的基因载体)
  7. 95%乙醇
  8. 葡萄糖
  9. 抗生素 (潮霉素、G418或除草剂Basta)
  10. 封口胶
  11. KT (Kinetin) (Sigma, catalog number: K-0753)
  12. 6-BA (6-BenzylaminoPurine) (Sigma, catalog number: B-5898)
  13. IAA (Indole-3-acetic acid) (Sigma, catalog number: I-5148)
  14. NAA (Napthalene acetic acid) (Sigma, catalog number: N-0640)
  15. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) (Sigma, catalog number: D-8407)
  16. CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) (Sigma, catalog number: C-7290)
  17. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
  18. Cn (Carbenicillin) (GiBco BRL, catalog number: 10177-012)
  19. Hn (hygromycin B) (GiBco BRL, catalog number: 10687-010)
  20. AS (Acetosringone) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
  21. Pyridoxine HCl (Sigma, catalog number: P-8666)
  22. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
  23. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
  24. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
  25. Phytagel HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8169)
  26. Dimethyl Sulfoxide-DMSO (Sigma, catalog number: D-5879)
  27. X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) (Sigma, catalog number: B-3783)
  28. NH4NO3
  29. KH2PO4
  30. KNO3
  31. MgSO4·7H2O
  32. CaCl2
  33. CaCl2·2H2O
  34. MnSO4·4H2O
  35. ZnSO4·7H2O
  36. KI
  37. H3BO3
  38. Na2MoO4·2H2O
  39. CoCl2·6H2O
  40. CuSO4·5H2O
  41. (NH4)SO4
  42. MnSO4·H2O
  43. FeSO4·7H2O
  44. Na2·EDTA·2H2O
  45. KCl
  46. NaH2PO4
  47. NaMoO4·2H2O
  48. KOH
  49. HgCl2
  50. Proline
  51. Sucrose
  52. MSmax储备液(10x) (见溶液配方)
  53. MSmin储备液(100x) (见溶液配方)
  54. N6max储备液(10x) (见溶液配方)
  55. N6min储备液(100x) (见溶液配方)
  56. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
  57. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
  58. AAmax储备液(10x) (见溶液配方)
  59. AAmin储备液(100x) (见溶液配方)
  60. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  61. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  62. 2,4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  63. 100 mM AS储备液(见溶液配方)
  64. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  65. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  66. 1 N KOH储备液 (见溶液配方)
  67. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)
  68. 诱导培养基 (见溶液配方)
  69. 继代培养基 (见溶液配方)
  70. 预培养基 (见溶液配方)
  71. 共培养基 (见溶液配方)
  72. 悬浮培养基 (见溶液配方)
  73. 筛选培养基 (见溶液配方)
  74. 分化培养基 (见溶液配方)
  75. 生根培养基 (见溶液配方)
    注：以上所有常规试剂如NH4NO3, KH2PO4等都是由国药化工或光复化工公司提供。

仪器设备

  1. 超净台
  2. 100 ml、250 ml、500 ml三角瓶
  3. 生根管
  4. 枪形镊
  5. 小铁勺
  6. 酒精灯
  7. 水洗杯
  8. 剪刀
  9. 28 °C摇床
  10. 19 °C培养箱

实验步骤

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：陈秋红, 陈太钰, 林拥军, 陈浩. (2018). 根癌农杆菌介导的粳稻遗传转化. Bio-101: e1010174. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010174.
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How to cite: Chen, Q. H., Chen, T. Y., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated Genetic Transformation of Japonica Rice. Bio-101: e1010174. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010174.
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分类

植物科学 > 植物转化 > 农杆菌介导的转化方法

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