实验原理:与动物类似,植物在受到一定的外界刺激和在特定的发育阶段,特定类型的细胞会发生细胞程序性死亡(PCD),该过程的显著特征之一是细胞核中的DNA会发生片段化。将经过变性处理的很多发生了PCD的单个细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶中,在普通的DNA电泳过程中,片段化的DNA会被电泳出细胞
,这些细胞用灵敏的DNA荧光染料染色后,会观察到一个圆形的细胞核带着一个DNA拖尾,形状似“彗星” (comet),所以这种基于单细胞电泳的方法也称Comet assay。最后,通过一个可以分别计算“彗星”头部和拖尾中的荧光强度(对应着DNA的量)的软件,然后算出尾部DNA(发生了片段化的DNA)所占整个细胞核DNA的百分数,该值即可定量的反映该细胞的PCD程度。
理论上,水稻任何组织器官的细胞都可以做PCD的定量检测,但要尽量保证细胞种类的一致性。本方法中所提到实例的实验材料是野生型水稻品种中花11 (ZH11)和一个绒毡层细胞PCD过程受到抑制的水稻突变体(
osapi5-1)的花药。
实验目的:定量检测某处理下细胞的DNA片段化程度。
材料与试剂
- 离心管
- 载玻片
- 玻璃平皿 (5 cm直径)
- 尼龙滤膜 (Millipore,孔径100 nm)
- 水稻突变体(osapi5-1)
- 水稻品种中花11
- 冰
- 低熔点琼脂糖
- Comet Assay Reagent Kit (Trevigen,catalog number: 4250-050-K)
- 1x PBS (Ca离子和Mg离子free,非常重要)
- 1.2% (w/v) NaOH
- 1x TBE
- 70%的乙醇
- 1x TE
- 甘油
注:化学试剂全部购自sigma公司,除了乙醇和甘油。
仪器设备
- 冰箱
- 手术刀
- 普通水平DNA电泳设备
- 荧光显微镜(Leica DM4000B with CCD camera Leica DFC480)
实验步骤