实验原理:根据相似相容原理溶解抽提类胡萝卜素,再用高效液相色谱法分离检测,高效液相色谱是色谱法的一个重要部分,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱
,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分离和分析。
实验目的:可以检测水稻愈伤组织、叶片、种子等组织中类胡萝卜素含量,包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、紫黄质的含量。
材料与试剂
- 50 ml离心管,10 ml离心管
- 各种型号的枪头
- 1 ml注射器 (上海治宇医疗器械有限公司)
- 0.22 μm滤膜 (津腾尼龙66)
- 水稻组织样品
- 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
- BHT (3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯) (Sigma, USA, CAS: 128-37-0, HPLC)
注:做为抗氧化剂保护类胡萝卜素成分也可作为内参做定 量分析,此试剂 也可用维生素E代替。
- MTBE (甲基叔丁基醚) (Sigma, USA, CAS: 1634-04-4, HPLC)
注:做为类胡萝卜素溶解液。
- TEA (三乙胺) (国药试剂,分析纯)
- 乙腈 (Fisher, USA, CAS: 75-05-8, HPLC)
- 甲醇 (Fisher, USA, CAS: 67-56-1, HPLC)
- 正己烷 (国药试剂,分析纯)
- 丙酮 (国药试剂,分析纯)
- 无水乙醇 (国药试剂,分析纯)
- α-胡萝卜素 (Sigma St Louis, MO, USA)
- β-胡萝卜素 (Sigma St Louis, MO, USA)
- 叶黄素 (Sigma St Louis, MO, USA)
- 紫黄质 (Sigma St Louis, MO, USA)
- 抽提Buffer (见溶液配方)
仪器设备
- 超低温冰箱
- 天平
- 低温干燥仪 (Heto Lyolab 3000,Denmark)
- 超声波仪 (昆山市超声波仪器有限公司)
- 真空旋转仪 (Eppendorf concentrator 5301,USA)
- 离心机 (Backman, USA)
- 液相色谱仪 (Agilent 1100 series, USA)
- 玻璃上样瓶及塑料内插管 (Agilent, USA)
- 液相色谱柱:reverse-phase YMC 5-μm C30 column (250 x 4.6 mm)
实验步骤
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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