Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

凝胶阻滞(EMSA)

EMSA Protocol

王 王鹏
杨 杨莹
余四斌 余四斌

发表时间: 2018年03月15日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010132 浏览次数: 20725

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实验原理：Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)是一种研究DNA结合蛋白或RNA蛋白质与其相关的DNA结合序列或RNA序列相互作用的技术，可以用于定量或者定性分析(Hellman and Fried, 2007)。将纯化的蛋白或细胞粗提液和32P同位素3’末端标记的DNA或RNA核酸探针一同温育，然后在非变性的聚丙烯凝胶电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中移动的速度慢，出现相对滞后的条带(图1)。通常可以用来作为验证转录因子和启动子特异元件直接结合调控转录的in vitro证据。


图 1. 凝胶阻滞实验基本原理图

实验目的：体外分析DNA或RNA探针与特异性蛋白质或蛋白复合体之间的互作。

Keywords: DNA－蛋白互作 search 凝胶阻滞 search 电泳 search 放射自显影 search

材料与试剂

  1. 离心管
  2. 滤纸
  3. 保鲜膜
  4. X光片
  5. 大片段DNA聚合酶 (Large Fragment DNA Polymerase I) (Invitrogen, USA, catalog number: 18012-021)
  6. dNTP* (专用), 由dATP, dTTP, dGTP (Takara, Japan, catalog numbers: D4026A, D4027A, D4029A) 1:1:1配制，即各取1 μl，再加入497 μl灭菌ddH2O混匀
  7. 10x M buffer (TaKaRa, catalog number: CA1401B) (Takara酶切试剂中附带的紫盖buffer)
  8. 10x Loading Buffer (TakaRa, catalog number: CA2601A) (Takara酶切试剂中附带)
  9. 30% Acrylamide
  10. Tris base
  11. HCl
  12. SDS
  13. AP (过硫酸胺)
  14. TEMED
  15. 甘油
  16. α 32P dCTP
  17. MgCl2
  18. NaCl
  19. EDTA
  20. DTT
  21. 甘氨酸 (Glycine)
  22. BSA
  23. 分离胶 (见溶液配方)
  24. 10x binding Buffer (见溶液配方)
  25. 电泳缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 蛋白质分离胶电泳仪 (同位素室配置)
  2. 离心机
  3. 盖革计数器
  4. 同位素室
  5. 暗室
  6. 红光灯

实验步骤

Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王鹏, 杨莹, 余四斌. (2018). 凝胶阻滞(EMSA). Bio-101: e1010132. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010132.
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How to cite: Wang, P., Yang, Y. and Yu, S. B. (2018). EMSA Protocol. Bio-101: e1010132. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010132.
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分类

分子生物学 > 蛋白质 > 蛋白质-DNA结合

生物化学 > 蛋白质 > 电泳

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