材料与试剂

1. 离心管
   
2. 液氮
   
3. 三氯乙酸 (Trichloroacetic acid, TCA)^① (Sigma, USA, catalog number: T6399)
   
4. 苯甲基磺酰氟 (PHenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)^② (Sigma, USA, catalog number: P7626)
   
5. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Fluka, USA, catalog number: 63690)
   
6. 二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) (Sigma, USA, catalog number: 43815)
   
7. 尿素 (Urea) (Sigma, USA, catalog number: U6504)
   
8. 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS) (Sigma, USA, catalog number: C9426)
   
9. Tris (ANGUS chemical company, USA, catalog number: 77-86-1)
   
10. 丙酮 (Acetone) (Sigma, USA, catalog number: 650501)
    
11. Protease inhibitor cocktail (Amersham Bioscience, USA, catalog number: 80-6501-23)
    
12. Nuclease mix (Amersham Bioscience, USA, catalog number: 80-6501-42)
    
13. 冰乙酸 (Acetic acid) (J&K scientific, USA)
    
14. 甲醇 (Methanol) (Fisher scientific, USA)
    
15. 乙醇 (Ethanol) (Sigma, USA, catalog number: E7023)
    
16. 甲醛^③ (Formaldehyde solution) (Sigma, USA, catalog number: F8775)
    
17. 硫代硫酸钠 (Sodium thiosulfate，Na₂S₂O₃) (Sigma, USA, catalog number: 72049)
    
18. 硝酸银 (Silver nitrate，AgNO₃) (Sigma, USA, catalog number: S7276)
    
19. 碳酸钠 (Sodium carbonate，Na₂CO₃) (Sigma, USA, catalog number: S7795)
    
20. 乙二胺四乙酸 (Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) (Fluka, USA, catalog number: 31064)
    
21. Solution A (见溶液配方)
    
22. Solution B (见溶液配方)
    
23. Lysis Buffer (见溶液配方)
    
24. 0.2 M PMSF (见溶液配方)
    

仪器设备

1. Ettan^TM IPGpHor Ⅱ^TM等电聚焦仪 (Amersham Bioscience, USA)
   
2. Ettan^TM DALTtwelve System电泳仪 (Amersham Bioscience, USA)
   
3. 通风橱
   
4. 摇床
   
5. 研钵
   
6. -20 °C冰箱
   
7. -70 °C冰箱
   
8. 冷冻真空干燥仪
   
9. 天平
   
10. 移液器
    
11. 振荡器
    

实验步骤

一、三氯乙酸-丙酮沉淀法抽提水稻叶片蛋白

1. 取新鲜水稻叶片，置于预冷研钵(预先于-20 °C冷冻)中，用液氮研磨成细粉末。
   
2. 取200 mg细粉末，装入1.5 ml硅化处理的离心管中，加入1 ml预先于-20 °C预冷的Solution A (溶液配方1)，充分振荡后，于-20 °C放置至少45 min (推荐过夜放置)。
   
3. 4 °C，13,000 rpm离心15 min。
   
4. 吸弃上清，加入1 ml预先于-20 °C预冷的Solution B (溶液配方2)，重悬沉淀后充分振荡，于-20 °C放置1 h。
   
5. 4 °C，13,000 rpm离心15 min。
   
6. 吸弃上清，重复用Solution B清洗样品至沉淀颗粒无色(沉淀颜色变化为绿-黄-白)。
   
7. 将样品置于冷冻真空干燥仪中干燥，之后放置于-70 °C过夜。
   
8. 按1:1 (mg:ml)的比例加入Lysis Solution (溶液配方3)，重悬沉淀。
   
9. 室温放置1 h后于4 °C，10,000 rpm/min 离心10 min，收集上清至另一1.5 ml离心管中。
   
10. 将收集的上清于4 °C，10,000 rpm/min 离心10 min后，收集上清，可提高样品质量，但样品量会有所损失。
    
11. 测量浓度后将样品置于-70 °C保存。
    
    

二、双向电泳分离待测样品

1. 一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供的操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10 mg/ml，否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。一相等电聚焦于Ettan^TM IPGpHor Ⅱ^TM等电聚焦仪(Amersham Bioscience, USA)上进行，仪器运行参数如下：
   

   Rehydration	30 V	12 h (20 °C)
   Grad	100 V	1 h
   Grad	200 V	1 h
   Grad	500 V	1 h
   Grad	1000 V	1 h
   Grad	8000 V	24,000 Vh
   Step	8000 V	12,000 Vh
   Step	1000 V	4 h (实际运行1-1.5 h)

   注：不同厂家的仪器参数会有不同，请按照厂家使用说明书进行设置。
   
2. 等电聚焦完毕后(约需24 h)，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70 °C保存数月。
   
3. 等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于Ettan^TM DALTtwelve System电泳仪(Amersham Bioscience，USA)上用12.5% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5 W/胶45 min，15 W/胶5-8 h，20 °C。
   
   

三、银染法对凝胶进行染色

1. 固定：凝胶于含5%冰乙酸和40%甲醇的溶液中放置过夜。也可于含10%冰乙酸和40%甲醇的溶液中摇晃15 min (摇床转速60 rpm)。
   
2. 清洗：凝胶置于35%乙醇中摇动清洗3次 (摇床转速60 rpm)，每次20 min。
   
3. 增敏：凝胶置于0.02%的硫代硫酸钠中增敏2 min。
   
4. 清洗：用去离子水清洗3次，每次5 min (摇床转速60 rpm)。
   
5. 染色：加入0.25%硝酸银溶液染色20 min。
   
6. 清洗：用去离子水清洗2次，每次1 min (摇床转速60 rpm)。
   
7. 显影：加入2.5% Na2CO3溶液，迅速用手晃动至溶液呈暗黄色；之后倒掉溶液，加入含2.5% Na2CO3和0.04%甲醛的水溶液显影至凝胶上黑点出现 (黑点即蛋白点)。
   
8. 定影：倒掉显影液，加入1.46% EDTA定影10 min。
   
9. 水洗：去离子水洗3次，每次10 min (摇床转速60 rpm)，然后将凝胶置于1%乙酸中于4 °C保存。
   
   

四、凝胶扫描及图像分析

1. 图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner (Amersham Biosciences, USA)以300 dpi，16-bit模式(65536灰阶)进行扫描。
   
2. 图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%乙酸中于4 °C保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software(Version 5.0，Institute of Bioinformatics, Swiss)软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以最小点面积(a minimum spot area)30，平滑度(smooth)2为主要参数最大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
   

注意事项

1. TCA：TCA有毒性，有刺激性气味，损害呼吸道、眼睛及皮肤，称量时应戴手套及口罩，避免沾到皮肤及吸入，若不慎接触，应立即用大量水冲洗后就医。TCA易潮解，称量时应迅速。
   
2. 甲醛：有刺激性气味，易挥发，其蒸气强烈刺激粘膜、眼睛，具致癌性。使用时应戴手套及口罩，在通风橱内操作。
   
3. 甲醇：有毒，能引起失明。二硫苏糖醇(DTT)：很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜，在通风橱中操作。beta-巯基乙醇：可致命，对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害。丙酮：对神经系统有麻醉作用，并对黏膜有刺激作用。
   

溶液配方

1. Solution A
   10% (w/v) 三氯乙酸
   20 mM二硫苏糖醇或0.07% (v/v) β-巯基乙醇
   1 mM PMSF
   丙酮 (配制前于-20 °C预冷)
   
2. Solution B
   20 mM二硫苏糖醇或0.07% (v/v) β-巯基乙醇
   1 mM PMSF
   丙酮 (配制前于-20 °C预冷)
   
3. Lysis Buffer
   8 M Urea
   4% (w/v) CHAPS
   40 mM Tris
   1% (v/v) protease inhibitor cocktail
   1% (v/v) nuclease mix
   灭菌去离子水
   
4. 0.2 M PMSF
   异丙醇配制
   注：PMSF有剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，称量时应戴手套及口罩，避免沾到皮肤及吸入，若不慎接触，应立即用大量水冲洗后就医。PMSF溶于异丙醇后置于-20 °C长期保存，保存中易析出结晶，用前取出待结晶溶化后再使用。