一、用反向PCR分离水稻插入突变体侧翼序列

实验原理：在含有T-DNA的水稻插入突变体中，通过抽提突变体总DNA进行酶切并使酶切产物自连，可以得到由T-DNA片段和与其相邻的基因组DNA组成的有效环状DNA分子。由于T-DNA序列是已知的，通过在T-DNA上设计巢式PCR引物，可以迅速扩增上述有效环状DNA分子中与T-DNA相邻的基因组DNA片段，从而分离出T-DNA的侧翼序列 (图1)。
实验目的：分离水稻T-DNA插入突变体的侧翼序列。


图1. 反向PCR扩增T-DNA左端侧翼序列原理

材料与试剂

1. 2 ml离心管
   
2. 1.5 ml离心管
   
3. dNTP (Pharmacia, USA)
   
4. Xba I (Takara, Dalian, China)
   
5. T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)
   
6. rTaq (Takara, Dalian, China)
   
7. BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.1 (Applied Biosystems, USA)
   
8. 50%甘油
   

仪器设备

1. 电热恒温隔水式培养箱 (SGSP-02，黄石市恒丰医疗器械有限公司)
   
2. 冰箱 (BCD-243K F&R，新飞)
   
3. GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems，USA)
   
4. ABI3730xl测序仪 (Applied Biosystems, USA)
   

实验步骤