实验原理:Southern印记杂交 (Southern Blotting) 是将植物基因组总DNA酶切,通过琼脂糖凝胶电泳分离,变性之后利用虹吸原理印记到固相支持物上 (如尼龙膜),然后与变性的同位素标记探针特异性地在一定温度下退火,最后根据同位素标记情况分析杂交结果的分子生物学技术。
实验目的:Southern Blotting可用于多种实验目的,比如检测目的片段拷贝数,限制性片断长度多态性分析、外源基因的整合模式等等,该操作说明适用于水稻的目的片段拷贝数检测。
材料与试剂
- 两个玻璃盘 (强烈建议用两个玻璃盘,而不要用搪瓷盘来洗胶,搪瓷盘较小且边沿不圆滑,操作时容易弄破凝胶)
- 一个搪瓷盘 (用来放一些杂物,如垫片等)
- 玻璃棒,玻璃板
- 铲胶板,吸水纸,尺子,铅笔,小刀,一个300 g的重物 (最好重量比较分散)
- 两张用作盐桥的滤纸 (如果是19.5 cm x 10 cm的标准尼龙膜,建议滤纸尺寸为35 cm x 14.5 cm) 以及两张覆盖膜的滤纸,比膜的长、宽各略大0.5 cm即可
- Klenow 酶(1 U/µl) (试剂盒)
- Tris (Sigma, catalog number: T-1378, FW 121.1)
- 硼酸
- EDTA
- NaAC·3H2O
- 冰醋酸
- Agarose (Biowest, Lot: 122000)
- Hind III (Takara)
- Agarose (Invitrogen, catalog number: 75510-019)
- λDNA Marker (λ-EcoR14 I digest) (Takara, catalog number: CK1801E)
- 浓HCl (中平能化集团开封东大化工有限公司试剂厂)
- 溴酚蓝
- NaCl (国药)
- NaOH (国药)
- Tris (Trizona base)
- Tris-sodian citrate (柠檬酸钠) (国药)
- SDS (Bio Basic Inc., LJ0303B7011J)
- Southern Blot Hybridization Buffer
- Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.0 (Takara, Lot BK3201)
- TE buffer
- 10х TAE buffer (见溶液配方)
- TBE buffer (见溶液配方)
- Depurination Solution (见溶液配方)
- Denaturation buffer (见溶液配方)
- Neutralization buffer(见溶液配方)
- Nucleic acid transfer buffer (20x SSC) (见溶液配方)
- Southern Blot Hybridization Buffer (见溶液配方)
- 洗膜液 (2x SSC + 0.1% SDS) (见溶液配方)
仪器设备
- NanoDrop 2000 (Thermo)
- 电泳槽
- 水浴锅和干浴锅
- 扫磷屏的机器为FUJIFILM的FLA-5100多功能影像分析仪,磷屏为该仪器配件
实验步骤
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
分类
分子生物学 > DNA > 基因分型
分子生物学 > DNA > DNA 检测
植物科学 > 植物分子生物学 > DNA
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