第一部分：去垢剂提取T. denticola外膜成分

材料与试剂

生物材料

齿垢密螺旋体MHE菌株[25]。该菌株（源自T. denticola ATCC 35405）是一种等基因突变体，缺乏 Msp（一种重要的外膜蛋白）。我们在本研究中使用了T. denticola MHE，因为使用野生型 ATCC 35405 菌株很难将牙菌素与 Msp 分离 [20,24]。该菌株可根据要求向作者索取。虽然T. denticola MHE中携带的突变是通过对红霉素的抗性来选择的，但不需要抗生素压力来维持突变。

试剂

胰蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：211705）
脑心输液（Fisher Scientific，目录号：237500）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：611805000）
明胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706537）
(NH ₄ ) ₂ SO ₄（Thermo Scientific，目录号：OXCM0635B）
MgSO ₄ ·7H ₂ O（Thermo Scientific，目录号：AAA144910I）
K ₂ HPO ₄（Fisher Scientific，目录号：BP363）
KH ₂ PO ₄（Fisher Scientific，目录号：BP362）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：S271）
KOH（Fisher Scientific，目录号：P250）
KCl（Fisher Scientific，目录号：BP366）
Na ₂ HPO ₄（Sigma Millipore，目录号：567547）
MgCl ₂（Fisher Scientific，目录号：BP214）
焦磷酸硫胺素（TPP）（Sigma-Aldrich，目录号：C8754）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5400）
L-半胱氨酸盐酸盐（Fisher Scientific，目录号：BP376）
丙酮酸钠（Fisher Scientific，目录号：BP356）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38S）
丙酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1386）
正丁酸（Sigma-Aldrich，目录号：B10355-0）
N-戊酸（Sigma-Aldrich，目录号：V9759）
异丁酸（Sigma-Aldrich，目录号：I1754）
异戊酸（Sigma-Aldrich，目录号：12954-2）
D,L-甲基丁酸（Sigma-Aldrich，目录号：193070）
兔血清*，热灭活（Pel-Freeze Biologicals Rogers，目录号：31127）
Triton X-114（Anapoe-X-114）（Anatrace，目录号：APX114）
丙酮（Fisher Scientific，目录号：A18）
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152）
HCl（12.1 N）（Fisher Scientific，目录号：A144）
1 M Tris pH 6.8（Fisher Scientific，目录号：BP152）
DTT（Fisher Scientific，目录号：BP172）
SDS（Fisher Scientific，目录号：BP166）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229）
溴酚蓝（BPB）（Fisher Scientific，目录号：BP114）

解决方案

TYGVS 生长培养基和T. denticola补充剂（参见食谱）
1 M Tris，pH 8（参见配方）
溴酚蓝 (BPB) 凝胶上样溶液（参见配方）
_{含有 5 mM MgCl 2} (PBS) 的磷酸盐缓冲盐水（参见配方）

食谱

TYGVS 生长培养基和T. denticola补充剂[26,27]

TYGVS基础生长培养基

添加至约 900 mL 蒸馏水：

10.0克胰蛋白胨

脑心浸液5.0克

10.0克酵母提取物

10.0 克明胶

_{(NH 4} ) ₂ SO ₄ 0.5g

0.1g MgSO ₄ ·7H ₂ O

_{K 2} HPO ₄的 1.13

0.9克KH ₂ PO ₄

1.0克氯化钠

用蒸馏 H ₂ O中的 4 N KOH 将 pH 调节至 7.2

高压灭菌器（121°C，20 分钟，15 psi）。未添加的培养基可在 4 °C 下保存长达六个月。

使用前无菌添加 100 mL TYGVS 补充剂（如下所述）。

含有补充剂的完整培养基可在 4 °C 下保存长达 1 个月。

TYGVS 补充剂

将以下物质混合在一起，用 4 N KOH 调节至 pH 7.2，并过滤灭菌。

每升最终体积培养基的量：

0.0125克TPP

1.0克葡萄糖

1.0 g L-半胱氨酸盐酸盐

0.25克丙酮酸钠

0.27 mL 冰醋酸

0.1 mL 丙酸

0.064 mL 正丁酸

0.016 mL 正戊酸

0.016 mL 异丁酸

0.016 mL 异戊酸

0.016 mL D,L-甲基丁酸

100 mL 兔血清*，热灭活

搅拌均匀；用 4 N KOH 将 pH 调至 7.2。

使用 0.2 μm 真空过滤装置进行灭菌。

*注：也可以使用热灭活的马或牛血清，生长情况差异不大。

1 M Tris，pH 8

将 12.11 g Tris 混合在 80 mL H ₂ O 中。通过滴加 1M HCl 将 pH 调节至 8。

溴酚蓝 (BPB) 凝胶上样溶液 (10 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
1 M Tris pH 6.8 的蒸馏 H ₂ O溶液	360毫米	3.75毫升
数码地面电视	600毫米	0.93克
安全数据表	12%	1.2克
甘油	60%	6毫升
BPB	0.018%	18毫克

_{含有 5 mM MgCl 2} (PBS)的磷酸盐缓冲盐水

氯化钠 80 克/升

氯化钾2克/升

Na ₂ HPO ₄ 14.4克/升

KH ₂ PO ₄ 2.4克/升

氯化镁₂ 1.0克/升

蒸馏水_， 900 mL

用 4 N KOH 将 pH 调至 7.4；然后，用 H ₂ O将体积校正至 1 L

实验室用品

培养生长容器。尺寸受到通过厌氧室端口的能力的限制。我们通常使用 2 L Corning Pyrex 瓶（Corning，目录号：13952L）
分光光度比色皿：聚苯乙烯，2 mL（Fisher Scientific，目录号：14955127）
离心管：
1. 250 mL（标称），Nalgene，聚丙烯共聚物（Thermo Scientific，目录号：31410250）。这些管将适合 GSA 型转子
2. 50 mL（标称），Oak Ridge 型（Thermo Scientific，目录号：31190050）（聚丙烯共聚物）和 31180050（聚碳酸酯）。这些管将适合 SS-34 型转子
3. 15 mL，锥形，聚丙烯（Corning，目录号：430766 或同等产品）。这些管将适合 STR40R 或同等离心机中适当的吊桶转子插件
4. 50 mL，锥形，聚丙烯（Corning，目录号：430291）或同等物。这些管将适合 STR40R 或同等离心机中适当的吊桶转子插件
真空过滤器单元（0.2 µm）（Thermo Scientific，目录号：5650020）

设备

厌氧室（Coy Lab Products，Grass Lake，密歇根州或同等机构）。我们使用 Coy B 型乙烯基厌氧室。 Coy 和其他制造商还生产带手套或不戴手套的刚性（金属或聚合物壁）厌氧室，其广告宣传为具有与“经典”乙烯基室相当的性能
压缩气罐：预纯化氮气（NITPP；Cryogenic Gases，底特律，密歇根州）；混合气体（10% H ₂、5% CO ₂、85% N ₂）（5CO10H2N2；Cryogenic Gases，底特律，密歇根州）。特种气罐调节器（Grainger, Lake. Forest, IL）
II 级生物安全柜（Advance SG403，Baker，Sanford，ME）。T. denticola通常被归类为 RG2 微生物，需要 BSL2 遏制和程序
带转子的高速离心机，适用于 15 mL、50 mL 和 250 mL 管
1. Sorvall RC2-B（或同等产品），带 GSA 转子，适用于 250 mL 管；用于 50 mL Oak Ridge 管的 SS-34 转子
2. Sorvall ST40R（或同等产品）配备用于 15 mL 和 50 mL 管的水平转头
生物危险废物真空捕集系统
1. SPE 真空泵捕集阱套件（Millipore Sigma，目录号：57120-U）
2. Whatman Vacu-Guard 在线过滤器（Cytiva，目录号：67225001）
3. 实验室“室内”真空系统或小型真空泵（Southern Labware，目录号：167300-11）
pH计：Accumet AE 150（或同等产品）（Fisher Scientific，目录号：13-636-AE153）
分光光度计（Dayton，型号 1200，Unico）
平台摇床（Labnet Orbit 1000，目录号：S20301000B）

程序

T. denticola的去垢剂萃取和相分配用于分离外膜蛋白。该过程温和地溶解T. denticola外膜，释放外膜和周质蛋白，同时保持原生质圆柱体完整。非离子去垢剂 Triton-X114 的溶液在 0 °C 下是均匀的，但在 20 °C 以上会分离成水相和去垢剂相 [28–30]。该特征可用于极大地富集洗涤剂相中的疏水性膜相关脂蛋白，而周质蛋白在水相中分离。这种方法用于螺旋体研究，既可以分离其丰富的脂蛋白，也可以区分可溶性周质蛋白和外膜成分[1,14,20,30–33]。虽然许多研究人员在此过程中加入了蛋白酶抑制剂混合物，但我们在此不包括此步骤，因为它会妨碍我们获得具有蛋白水解活性的蛋白质复合物的目标。图 1 说明了洗涤剂提取和制备型电泳样品制备过程中涉及的步骤。

在完全 TYGVS 培养基 [26,27] 中，在厌氧条件（10% H ₂、5% CO ₂、85% N _{2 ）下，在 37 °C 下将}T. denticola菌株 MHE [25]培养至对数后期（3-4 天））。在标准分光光度计中测量，600 nm 处的预期光密度约为 0.3–0.4。 MHE 菌株用于牙菌素纯化，因为它缺乏主要的外膜蛋白 Msp，使用这些方法很难将其与牙菌素分离。对于此过程，我们通常培养最多 4 L 的培养物（每个培养瓶最多 2 L），每升培养物将产生约 1.5 mL 的最终步骤提取物，浓度约为 500 µg/mL [14]。
使用 250 mL Nalgene 离心管离心（4,000× g ，10 分钟，4°C）收获培养物。将原始培养物体积的一半重悬于含有 5 mM MgCl ₂的 PBS (pH 7.4) 中，如上所述离心，并重复洗涤/离心步骤两次。在每个步骤中，通过轻轻移液到小体积 (10–20 mL) 的相同 PBS+MgCL ₂缓冲溶液中悬浮沉淀，然后添加剩余体积。
如上所述，将沉淀重悬于含有 5 mM MgCl ₂和 1% Triton X-114 的 PBS 原始培养物体积的 1/40 中。

注意：Triton X-114 以 10% 水溶液形式提供。 Triton X-114 使用小容量容器，因为它暴露在空气中后很容易被氧化。
将悬浮液在平台摇床上的 Oak Ridge 管中于 4°C 下轻轻摇动过夜。
在 4°C下以 20,000× g离心10 分钟，分离并沉淀不溶解的物质，这些物质主要是螺旋体细胞的原生质圆柱体 [35]。
将含有洗涤剂可溶性物质的透明上清液转移至新的 15 mL 锥形管中。在混合物中添加一滴溴酚蓝溶液 (0.04%) 有助于在后续分离步骤中观察洗涤剂相，而不影响感兴趣的蛋白质 [32]。提取物可立即处理或储存在 -80 °C 直至进一步处理，这通常在几天内完成。
将提取物在 37°C 下孵育 30 分钟。溶液将变得混浊。
将转子预热至 37°C，然后在吊桶转子中于 37°C 下以 3,500× g离心提取物 10 分钟。提取物应分离成约 1/10 总体积的水性上层相和洗涤剂下层相。如果分离不明显，离心速度和时间可增加至 20,000× g，持续 1 小时 [1,30]。如果有必要，请在聚碳酸酯 Oak Ridge 管中进行离心，因为与类似的聚丙烯管相比，它们可以承受更高的速度并且更容易观察洗涤剂颗粒。
小心地从下相中除去所有痕量的水相。
_{用含有 5 mM MgCl 2} (4 °C)的 PBS 稀释剩余的洗涤剂相，使其达到相分离前的原始体积。这将使 Triton X-114 浓度恢复到大约 1%。重复相分离步骤 4-9 两次。
将最终的下层（洗涤剂）相转移至新的 50 mL 聚丙烯 Oak Ridge 管中。请注意，聚碳酸酯管与丙酮不相容。
在电泳前用丙酮沉淀去污剂相，以去除样品中的 Triton X-114 去污剂。添加 8 体积的冷丙酮 (-20 °C)，并在 -20 °C 下孵育至少 1 小时，但不超过 20 小时。在 4°C 下以 12,000× g离心 30 分钟。小心地从软颗粒中倒出丙酮。让沉淀部分干燥，然后溶解在 1/2 体积的含有 5 mM MgCl ₂的 PBS 中。洗涤剂相样品在 PC-PAGE 之前通常不需要进一步浓缩。
样品可以储存在 -80 °C 下，直到在 Prep Cell 上进行纯化，如下节所述。我们通常会在可行的情况下尝试尽快进行 PC-PAGE 步骤。

第二部分：PC-PAGE 用于纯化T. denticola dentilisin 复合物

牙菌素蛋白酶复合物可通过在 491 型制备池中进行制备型电泳从先前步骤中制备的去污剂相提取物中纯化。该复合物由三种脂蛋白（PrcB、PrcA 和 PrtP）组成，在电泳前未加热时在 SDS-PAGE 条件下非常稳定，并保留蛋白水解活性 [13,21,24,36,37]。这种 PC-PAGE 技术适用于纯化表观分子量与 SDS-PAGE 中最接近的分子量相差超过 5% 的蛋白质。对于齿状菌素，去污剂提取/相分配程序从原始粗制品中去除了大量蛋白质，并且可以以适合许多功能测定的纯度水平有效回收大约 95 kDa 的天然蛋白酶复合物。

运行前的准备工作在开始凝胶运行的前一天完成。包括预运行在内，整个样品采集过程大约需要三天时间，不包括通过 SDS-PAGE 和银染对级分进行表征。

材料与试剂

生物材料

上述制备的T. denticola MHE的洗涤剂相提取物

试剂

30% 丙烯酰胺/双溶液，37.5:1（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0158）
Tris pH 8.8，1.5 M H ₂ O溶液
Tris-HCl pH 6.8，1.25 M H ₂ O溶液
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Invitrogen，目录号：15525017）
四甲基乙二胺（TEMED）（Invitrogen，目录号：15524）
过硫酸铵（APS）（Thermo Scientific，目录号：32708）
溴酚蓝 6× 染料溶液（Thermo Scientific，目录号：J61337.AC）
CHAPS（3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基铵]-1-丙磺酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：C3023）
二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific 目录号：23225）
辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗兔 IgG（H+L）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706515）
SuperSignal West Pico 化学发光底物（Thermo Scientific，目录号：34580）
牙本质活性检测：
1. N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-对硝基苯胺（SAAPFNA）（Sigma-Aldrich，目录号：S7388）
2. N,N-二甲基甲酰胺（Thermo Scientific，目录号：AC42364）
3. SAAPFNA 库存：50 mM N,N-二甲基甲酰胺溶液。储存于-20°C
4. 反应缓冲液：(1×) 50 mM Tris、0.2 M NaCl、5 mM DTT，pH 7.5。制成 10× 库存并储存在-20°C。
5. α-胰凝乳蛋白酶，II 型作为对照。使用前在反应缓冲液中稀释：1 mg/mL 并进一步 1/10 稀释（Sigma-Aldrich，目录号：C4129）
6. 平底 96 孔微孔板（Fisher Scientific，目录号：FB012931）

解决方案

6× Laemmli SDS 样品缓冲液（参见配方）
上部电泳室（阴极）缓冲液（参见配方）
下层电泳室（阳极）缓冲液（参见配方）
下层电泳室（阳极）缓冲液（参见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
电泳后缓冲液更换（参见配方）
APS 10% 的 H ₂ O 溶液（新鲜制备）

食谱

标准 SDS-PAGE 制备凝胶柱

分离胶：7.5%丙烯酰胺，直径为28毫米，凝胶高度为9.5厘米。

针对 37 mm 色谱柱或不同丙烯酰胺浓度进行适当缩放。

注意：丙烯酰胺单体是一种神经毒素。

30% 丙烯酰胺/双 37.5:1 9.5 mL

1.5 M Tris pH 8.8 9.5 mL

H ₂ O 18.4 毫升

10% 十二烷基硫酸钠 0.38 毫升

TEMED 0.02 毫升

10% APS 0.2 毫升

浓缩胶：2×样品体积（假设样品体积为5 mL）

30% 丙烯酰胺/双 37.5:1 1.3 mL

1.25 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 mL

H ₂ O 7.54 毫升

10% 十二烷基硫酸钠 0.10 毫升

TEMED 0.01 毫升

10% APS 0.05 毫升

6× Laemmli SDS 样品缓冲液

375 mM Tris-HCl/Tris 碱

9% SDS（重量/体积）

50% 甘油 (v/v)

9% 2-巯基乙醇 (v/v)

0.075% 溴酚蓝 (w/v)

上层电泳室（阴极）缓冲液（500 mL）

25 mM Tris (pH 8.8)

192 mM 甘氨酸

0.1% 十二烷基硫酸钠

下层电泳室（阳极）缓冲液（2,000 mL）

25 mM Tris (pH 8.8)

192 mM 甘氨酸

洗脱缓冲液（700 mL）

25 mM Tris (pH 8.8)

192 mM 甘氨酸

笔记：
1. 我们省略了阳极和洗脱缓冲液中的 SDS，以便收集的级分中残留的洗涤剂含量最少。我们发现这种修改对电泳和级分收集没有影响。
2. 使用前对所有缓冲液和筛板进行脱气。将筛子放入盘中，并用 Tris/甘氨酸缓冲液覆盖。将它们放入厌氧室的端口中，松开盖子，抽真空，孵育过夜，然后拧紧盖子，并保持在 4°C 直至使用。

电泳后缓冲液更换

含 0.1% CHAPS 的 PBS

设备

色谱冰箱或冷藏室（Thermo Scientific，TSX2305CA）
491 型制备细胞（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702928）
电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac 3000）
低压层析系统（Bio-Rad Laboratories，型号：BioLogic LP）
ChemiDoc MP 图像系统（Bio-Rad，型号：Universal hood III，目录号：731BR01488）
2128 型馏分收集器（流速：1 mL/min；馏分：5.0 mL；最多两个架子，每个架子 128 个管）（Bio-Rad Laboratories，目录号：731-8123）
变速缓冲液再循环泵（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702929）
样品浓缩器：
1. Millipore/Amicon 搅拌超滤池。有多种尺寸可供选择：50 mL（Millipore，目录号：UFSC05001）、200 mL（Millipore，目录号：UFSC20001）和 400 mL（Millipore，目录号：UFSC40001）。这是一个独立的装置，需要专用的氮气罐来提供过滤压力。与设计用于搅拌池的超滤盘膜一起使用。每种尺寸的搅拌池均提供圆盘尺寸（Cole-Parmer, Inc.，型号：Millipore EW-29949）
2. Amicon Ultracel 30 离心浓缩装置（Millipore，目录号：UFC9030）。这些是适用于 ST40R 离心机的一次性过滤装置。它们有多种其他体积和截留分子量可供选择。虽然相对便宜，但大型项目的成本会迅速增加
压缩氮气罐（NITPP；Cryogenic Gases，密歇根州底特律）
氮气罐专用气体调节器（Grainger，型号：Harris KH1008）。搅拌池浓缩器利用气压进行样品浓缩
酶标仪（Molecular Devices，型号：VERSAmax）。读板器用于测定牙菌素对显色底物N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-对硝基苯胺(SAAPFNA) 的活性 [21]

程序

Bio-Rad 说明手册中提供了 491 型制备池组装和操作的详细说明。图 1 说明了上述第一部分中制备的样品的制备型电泳所涉及的步骤。以下是该应用的具体项目。

按照手册中的说明将 28 mm 直径的玻璃凝胶管组件组装在其铸造支架上。对于较大批量的制备，使用直径 37 mm 的玻璃凝胶管可能会很有用，凝胶组分体积相应扩大。
在铸造台上设置后，通过冷却芯在冰上连续注入水流。
制备7.5%丙烯酰胺分离胶（总体积：38 mL）：9.5 mL 30%丙烯酰胺/Bis 37.5:1； 9.5 mL 1.5 M Tris pH 8.8； 16.55mL dH ₂ O； 0.38 mL 10% SDS； 0.038mL TEMED； 2.66 毫升 1% APS。
倒入分离胶，每次三分之一体积，然后轻敲并摇动，以确保每次柱底或柱侧没有气泡。顶部加入 2 mL H ₂ O 饱和丁醇。
聚合约 1 小时后，弃去丁醇，用蒸馏 H ₂ O 洗涤两次，并用 25 mM Tris (pH 8.8)、192 mM 甘氨酸和 0.1% SDS 覆盖。可在 4°C 下放置 48 小时或更长时间，或在室温 (RT) 下放置过夜，以确保聚合完成。
倒入适当体积的浓缩胶（= 2×样品体积）。请注意，在制备池上加载 5 mL 样品的情况并不少见。对于 10 mL 浓缩胶：7.66 mL H ₂ O、1.0 mL 1.25 M Tris-HCl pH 6.8； 0.1 mL 10% SDS； 0.01 mL TEMED； 0.07。 1% APS 的毫升。如果分离胶处于室温，则让浓缩胶聚合 30 分钟。
根据制造商的说明拆卸浇铸架并在 491 型制备池中组装凝胶柱，特别注意支撑筛板、洗脱筛板、透析膜和 O 形圈的正确放置。
在色谱冰箱（或冷室）中，根据 BioLogic LP 色谱手册中的说明连接以下各项：
1. 缓冲冷却芯从上部缓冲室入口。
2. 缓冲冷却芯出口进入缓冲循环泵。
3. 从泵到下缓冲室的插口的出口。
4. 洗脱出口位于冷却芯顶部中部至生物逻辑系统泵入口处。
5. 确保您有一个单独的收集容器用于存放在开始收集馏分之前脱落的洗脱缓冲液。
将含有 192 mM 甘氨酸的 25 mM Tris (pH 8.8) 添加到堆积凝胶水平上方的下缓冲液室中。
在冰上解冻洗涤剂相提取物，并添加含有还原剂的 1/5 体积标准 6× SDS-PAGE 样品缓冲液。
按照制备细胞说明手册中的说明，使用巴斯德移液器通过切断的塑料移液器导轨添加样品。提前熟悉这种凝胶上样程序很有用。完成后，用手指密封导板的顶部开口，然后轻轻拉出导板，取下塑料移液管导板。
用 25 mM Tris (pH 8.8)、192 mM 甘氨酸和 0.1% SDS 填充上缓冲室。用 25 mM Tris (pH 8.8) 和 192 mM 甘氨酸缓冲液填充洗脱缓冲液室。
将 Prep Cell 的电极连接到 Bio-Rad PowerPac。设置为 60 mA 恒定电流，这应产生大约 550 V 的初始电压。
用 1.6 mm 管连接缓冲循环泵，并将流速设置为 1 mL/min。
在需要之前不要打开馏分收集器（即，直到染料前沿穿过凝胶之后）。设置分数收集以 1 mL/min 的流速收集 5 mL 分数。
通过银染 SDS-PAGE（每泳道 10 µL）筛选每十分之一的级分。含有预期 dentilisin 复合物的池级分在 95-100 kDa 处迁移。
在配有超滤盘膜过滤器的搅拌细胞超滤装置中，在 4°C 下将感兴趣的级分浓缩至少 10 倍。随后，在同一搅拌细胞系统中用 10 体积含有 0.1% CHAPS 的 PBS 洗涤 3 次，对样品进行缓冲液交换。或者，根据制造商的说明，在 4°C 下使用 Amicon Ultracel 30 离心过滤柱浓缩馏分并交换缓冲液。
按照制造商的说明，使用二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质测定法确定蛋白质浓度。如果需要，可以根据制造商的说明使用 Amicon Ultracel 30 离心过滤器在 4 °C 下进一步浓缩样品。
如前所述，使用显色底物 SAAPFNA 确定牙菌素蛋白水解活性 [21]。
1. 将 50 µL 样品缓冲液中的每个蛋白质样品和对照加载到 96 孔板的孔中（阴性对照：蛋白质样品缓冲液；阳性对照：蛋白质样品缓冲液加胰凝乳蛋白酶）。
2. 37°C 孵育 5 分钟，同时配制酶底物。
3. _在蒸馏水中按 1:5 稀释 10× 反应缓冲液。
4. 在所得 2× 反应缓冲液中按 1:50 稀释 SAAPFNA 底物原液。
5. 将 50 μL SAAPFNA 底物添加到每个孔中。使用样品缓冲液加底物作为空白。
6. 将板在 37°C 下孵育 5-30 分钟，仔细监测阳性孔与空白孔中的黄色变化。
7. 读取 405 nm 处的吸光度值。
将纯化的牙菌素以适当大小的等份储存在-80°C，以适应预期用途。在我们手中，正确保存的牙本质素样品可以稳定保存数年。

牙菌素纯化的每个步骤，包括生长、收获、去污剂提取/相分离和 PC-PAGE 如图 1 所示。全细胞中T. denticola prcB-prcA-prtP操纵子的蛋白质产物和纯化的牙菌素蛋白酶复合物的检测如下：如图2所示。

图 1.牙本质纯化工作流程。文本中描述了每个步骤的详细信息，包括生长、收获、去污剂提取/相分离和 PC-PAGE。

图 2.全细胞和纯化的牙菌素蛋白酶复合物中齿垢密螺旋体 prcB-prcA-prtP操纵子产物的检测。 A. 纯化蛋白酶复合物（每泳道 0.4 µg）的银染 SDS-PAGE，未加热（泳道 1）和煮沸（泳道 2）。指示了 PrtP、PrcA1、PrcA2 和 PrcB 频带的位置。显示了以 kDa (MW) 为单位的分子量标准。 B：T. denticola全细胞提取物和纯化的蛋白酶复合物的免疫印迹。所有样品在电泳前均煮沸。通过标准 SDS-PAGE 分离样品，然后转移到硝酸纤维素膜上。泳道 1：T. denticola全细胞提取物（相当于 10 µL 培养物）。泳道 2：纯化的牙菌素蛋白酶复合物（每泳道 0.4 µg）。首先用对 PrcB、PrcA1、PrcA2、PrtP-N 末端结构域和成熟 PrtP 特异的兔多克隆抗体探测膜 [24,37,38]，然后用辣根过氧化物酶 (HRP) 缀合的山羊抗兔 IgG 探测。使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物对感兴趣的蛋白质条带进行可视化。标明了每种多肽的近似大小（以 kDa 为单位）（MW）。经 Godovikova 等人许可转载。 [24]（图2）稍作修改。

第三部分：明胶酶谱法检测T. denticola dentilisin对 MMP-2 的激活

天然T. denticola dentilisin 直接激活重组 MMP-2

口腔螺旋体齿垢密螺旋体与牙周病高度相关。 T. denticola外膜蛋白复合物牙菌素有助于 PDL 细胞中 pro-MMP-2 的慢性激活，并引发 PDL 细胞中活性 MMP-2 激活剂和效应物表达水平的增加 [14,39]。尽管取得了这些进展，但尚未确定牙菌素诱导 MMP-2 激活的机制。明胶酶谱法是检测各种生物样品（包括培养基、细胞提取物、组织提取物和生物液体）中明胶分解活性的有效方法。这是通过利用已用明胶浸渍的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶来实现的。在本研究中，我们探讨了T. denticola dentilisin 直接激活 MMP-2的能力。这是通过在体外环境中使用天然纯化的牙菌齿菌素和重组MMP2来完成的，其中通过明胶酶谱法和原位明胶酶谱法测定MMP-2活化。

A. 明胶酶谱分析

材料与试剂

试剂

Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher，目录号：23225）
Pro-MMP-2（R&D Systems，目录号：902-MP-010）
4×样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
10% Zymogram plus（明胶）凝胶（Invitrogen，目录号：ZY00100）
10×凝胶电泳缓冲液（Novex，目录号：LC2675）
酶谱复性缓冲液（Novex，目录号：LC2670）
酶谱显影缓冲液（Novex，目录号：LC2671）
染色溶液（Simplyblue safestain）（Invitrogen，目录号：465034）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A452-4）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）

解决方案

脱色溶液（参见配方）

食谱

脱色液

10% 甲醇和 5% 乙酸的 dH ₂ O溶液

设备

XCell SureLock ^TM电泳槽（Thermo Fisher，型号：EI0001）
PowerPac ^TM Basic（Bio-Rad，型号：041BR93879）
Eppendorf 管（Eppendorf，目录号：0030 124.537）
ChemiDoc MP 图像系统（Bio-Rad，型号：Universal hood III，目录号：731BR01488）

软件和数据集

图像处理软件（ImageJ版本2.14.0/1.54f，https://imagej.net/ij/download.html）

程序

运行和显影凝胶

如前所述进行明胶酶谱分析[14]。
根据制造商的说明，使用 Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒计算每个样品的蛋白质浓度。
将不同浓度的纯化牙菌素和 pro-MMP-2 在室温下混合并孵育 30 分钟，并与 4× 样品缓冲液混合。然后，加载到每个孔中并在含有明胶的 10% 凝胶上进行 SDS-PAGE。
电泳后，用复性缓冲液清洗凝胶两次，每次 30 分钟，以除去凝胶中的 SDS。然后将凝胶放入展开缓冲液中 30 分钟。
更换显影缓冲液并将凝胶在 37 ℃ 孵育 16 小时。然后，用Simplyblue 安全染色剂染色30 分钟，然后使用 5% 乙酸和 10% 甲醇溶液脱色，直至在蓝色背景下出现清晰的条带。
使用 ChemiDoc MP 图像系统拍摄酶谱图片，并使用 ImageJ 软件测量活性 MMP-2 表达的带强度（图 3）。
对于图 3，使用单向方差分析 Tukey 的多重比较测试对数据进行比较。 **p < 0.01； *** p < 0.001。

图 3. 来自密螺旋体的牙菌素直接激活重组 MMP-2。上图：代表性明胶酶谱图像显示 MMP-2 的激活。底部：使用 ImageJ 软件测量活性 MMP-2 表达的条带强度 (n = 3)。使用单向方差分析 Tukey 的多重比较测试对数据进行比较。 **p < 0.01； ***= p < 0.001。

B. 原位明胶酶测定

材料与试剂

试剂

EnzChek ^TM明胶酶/胶原酶测定试剂盒（Invitrogen，目录号：E12055）
染料淬灭（DQ）明胶荧光底物（Invitrogen，目录号：E12054）
Pro-MMP-2（R&D Systems，目录号：902-MP-010）
Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher，目录号：23225）

设备

荧光酶标仪（Molecular Devices，型号：SPECTRA max，M2）
96孔板（Thermo Fisher，目录号：M33089）

软件和数据集

GraphPad Prism统计软件（GraphPad、Prism，版本10.1.1）

程序

将 80 mL 的 1× 反应缓冲液和 20 mL 的 1 mg/mL DQ 明胶荧光底物库存添加到每个测定孔中。
使用对照、纯化的 pro-MMP-2、纯化的 dentilisin 或 pro-MMP-2 和 dentilisin 以及明胶底物和反应缓冲液测试不同的样品组。根据制造商的说明使用 Pierce 的 BCA 蛋白质定量试剂盒确定每种纯化蛋白质的初始浓度为 1 mg/mL。
类似于先前描述的出版物 [40]，用反应缓冲液进一步稀释每种蛋白质的最终浓度为 0.002 mg/mL。
将 100 mL 终浓度的 1× 反应缓冲液（阴性对照）、单独的 MMP-2 或单独的牙菌素添加到各自分组的孔中。
将 50 mL 的最终浓度 MMP-2 加 50 mL 的最终浓度 dentilisin 添加到其各自的孔组中。
在 0、30、60、90 和 120 分钟时间点，在荧光酶标仪中以 495 nm 吸收和 515 nm 发射读取样品。
数据代表两次独立实验的平均值±SD（图4）。

图 4. 使用原位明胶酶谱法通过 dentilisin 直接激活 pro-MMP-2。在每个时间间隔（0、30、60、90 和 120 分钟）绘制每组的荧光强度。样品组是阴性对照、单独的纯化的pro-MMP-2、纯化的dentilisin、或pro-MMP-2和dentilisin两者。该图代表两个实验的平均值，每个实验由每组中的六个独立样本组成。

数据分析

使用单向方差分析和 Tukey 多重比较检验对数据进行比较（图 3，统计分析，Front Cell Infect Microbiol.2021 年 5 月 19 日；11：671968）。

协议验证

此处描述的牙菌素纯化和酶谱分析方案先前已在以下文献中报道和验证：

芬诺等人。 [20]。感染。免疫。 66：1869–1877。 doi：10.1128/IAI.66.5.1869-1877.1998（图 3）。
戈多维科娃等人。 [24]。感染。免疫。 79（12）：4868–75。 doi：10.1128/IAI.05701-11（图 2）。
苗等人。 [14]。感染。免疫。 79（2）：806-11。 doi：10.1128/IAI.01001-10（图 2、3B、4A、5A）。
苗等人。 [39]。拱。口腔生物学。 59（10）：1056-64。 doi：10.1016/j.archoralbio.2014.06.003（图1A和B，3C）。
马龙等人。 [17]。正面。细胞感染。微生物。 11:671968。 doi：10.3389/fcimb.2021.671968（图 4、7A、8A）。
甘瑟等人。 [16]。 PLoS Pathog。 17(7)：doi：10.1371/journal.ppat.1009311（图 4b，S2）。

致谢

这些研究得到了 NIH 的资助，具体如下：R01 DE025225 至 YLK 和 JCF； R01 DE018221 至 JCF； Ruth L. Kirschstein 个人博士前 NRSA 的 MD/PhD，以及 EM 的其他双学位奖学金 (F30 DE027598)；和 Ruth L. Kirschstein NRSA 机构研究培训补助金 (T32DE007306) 给 SG。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备中没有任何作用。这里描述的方案改编自作者之前报道的研究[14-16,20 22,24]。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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