材料与试剂

生物材料

用于蛋白质表达的 BL21 (DE3) pLysS 细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：C606010）
pET-28b-Pfu-Sso7d 质粒（加拿大约克大学 Alexander Klenov 博士赠送）（序列可从https://barricklab.org/twiki/pub/Lab/ProtocolsReagentsPfuSso7d/6his-pfu-sso7d-下载pET28.gbk )

试剂

三（羟甲基）氨基甲烷，氨丁三醇，Tris 碱（Sisco 研究实验室，目录号：71033）
Luria肉汤（LB）（Himedia，目录号：M575）
琼脂（Himedia，目录号：GRM026）
超级最佳分解代谢物（SOC）（Himedia，目录号：G015）
卡那霉素（Himedia，目录号：A008）
氯霉素（Himedia，目录号：CMS218）
脱氧核糖核苷酸（dNTP）（Sisco Research Laboratory，目录号：14464）
异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（Himedia，目录号：MB072）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sisco Research Laboratory，目录号：87606）
溶菌酶（Sisco Research Laboratory，目录号：45822）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sisco研究实验室，目录号：1948101）
丙烯酰胺1×晶体（Sisco研究实验室，目录号：89314）
双丙烯酰胺（Sisco Research Laboratory，目录号：38516）
过硫酸铵（APS）（Himedia，目录号：MB003）
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）（Sisco 研究实验室，目录号：84666）
β-巯基乙醇（Sisco 研究实验室，目录号：83759）
磷酸二氢钠（NaH ₂ PO ₄）（Sigma-Aldrich，目录号：71505-250）
甘油（Sisco 研究实验室，目录号：59991）
二硫苏糖醇（DTT）（Sisco研究实验室，目录号：17315）
溴酚蓝（Himedia，目录号：GRM914）
一对特异性引物（整合DNA技术）
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（Invitrogen，目录号：AM2222）
琼脂糖（Himedia，目录号：MB002）
甜菜碱溶液（Sigma-Aldrich，目录号：B0300）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Qualigens，目录号：Q18455）
乙醇，绝对浓度 99.9%（任何品牌）
丙酮（Sisco 研究实验室，目录号：31566）
吐温 20（默克，目录号：SB3S630097）
Triton X-100（Sisco 研究实验室，目录号：64518）
氯化钠（NaCl）（Sisco研究实验室，目录号：76945）
甘氨酸（Merck，目录号：MA7M562461）
考马斯亮蓝 R-250（Sisco 研究实验室，目录号：93473）
磷酸氢二钠十二水合物（Na ₂ HPO ₄ ·2H ₂ O）（Sisco研究实验室，目录号：83417）
超纯正磷酸二氢钾 AR，99.5% (KH ₂ PO ₄ )（Sisco Research Laboratory，目录号：50451）
Nonidet P-40（NP-40）（Thermo Fischer Scientific，目录号：28324）
牛血清白蛋白溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A8412）
乙酸（Sisco Research Laboratory，目录号：85801）
硫酸铵 [(NH ₄ ) ₂ SO ₄ ]（Sisco 研究实验室，目录号：88064）
硫酸镁（MgSO ₄）（Sisco 研究实验室，目录号：50014）
超纯氯化钾 AR，99.5% (KCl)（Sisco 研究实验室，目录号：38630）
盐酸，6N 水溶液 (HCl)（Sisco 研究实验室，目录号：17560）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E7637）
无水超纯氯化镁，98% (MgCl ₂ )（Sisco Research Laboratory，目录号：31196）

解决方案

磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
裂解缓冲液（参见配方）
存储缓冲区（参见食谱）
100 mM IPTG（参见配方）
1 M Tris-HCl，pH 6.8（参见配方）
1.5 M Tris-HCl，pH 8.8（参见配方）
4× SDS 染料（参见配方）
10× Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液（参见配方）
染色液（参见配方）
脱色溶液（参见配方）
10× PCR 缓冲液（参见配方）

食谱

PBS（100 毫升）

试剂	最终浓度	数量
Na ₂ HPO ₄ ·2H ₂ O	100毫米	1.779克
KH ₂ PO ₄	18毫米	0.244克
氯化钠	137毫米	0.8克
氯化钾	2.7毫米	0.02克
用 HCl/NaOH 将 pH 调节至 7.4
双蒸水	不适用	高达 100 毫升

高压灭菌并储存于 4 °C。

裂解缓冲液 (50 mL)

试剂	最终浓度	数量
氯化钠 (5 M)	300毫米	3毫升
NaH ₂ PO ₄（1 M，pH 8.0）	50毫米	2.5毫升
甘油（100%）	10%（体积/体积）	5毫升
海卫一 X 100 (10%)	0.1%（体积比）	0.5毫升
双蒸水	不适用	高达 50 毫升

储存于 4°C。使用前添加 0.5 mM PMSF 和 2 mg/mL 溶菌酶。

存储缓冲液（50 mL）

试剂	最终浓度	数量
乙二胺四乙酸 (0.5 M)	0.1毫摩尔	0.01毫升
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）	25毫米	1.25毫升
氯化钠 (5 M)	250毫米	2.5毫升
NP-40 (100%)	0.2%（体积比）	0.1毫升
甘油（100%）	50%（体积/体积）	25毫升
吐温 20 (100%)	0.2%（体积比）	0.1毫升
双蒸水	不适用	高达 50 毫升

过滤灭菌，等分，并储存在-20°C。使用前添加 2 mM DTT。

100 mM IPTG (10 mL)

试剂最终浓度数量

IPTG 100毫米 0.238克

双蒸水不适用高达 10 毫升

过滤灭菌，等分，并储存在-20°C。

1 M Tris-HCl，pH 6.8 (100 mL)

试剂最终浓度数量

Tris碱基 1M 12.1克

用 HCl/NaOH 将 pH 调节至 8.8

双蒸水不适用高达 100 毫升

高压灭菌并储存于 4 °C。

1.5 M Tris-HCl，pH 8.8 (100 mL)

试剂最终浓度数量

Tris碱基 1.5M 18.1克

用 HCl/NaOH 将 pH 调节至 8.8

双蒸水不适用高达 100 毫升

高压灭菌并储存于 4 °C。

4× SDS 染料 (5 mL)

试剂	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 6.8）	200毫米	1毫升
甘油（100%）	40%（体积/体积）	2毫升
安全数据表 (10%)	4%（重量/体积）	2毫升
溴酚蓝	0.08%（重量/体积）	0.004毫升
双蒸水	不适用	高达 5 毫升

等分并储存在-20°C。使用前添加 β-巯基乙醇至 5% (v/v)。

10× Tris-甘氨酸-SDS 缓冲液 (100 mL)

试剂最终浓度数量

Tris碱基 250毫米 3.03克

安全数据表 35毫米 1克

甘氨酸 1.92米 14.4克

双蒸水不适用高达 100 毫升

室温保存。

染色液（500 mL）

试剂	最终浓度	数量
甲醇（100%）	40%（体积/体积）	200毫升
乙酸（100%）	8%（体积/体积）	40毫升
考马斯亮蓝 R-250	0.1%（重量/体积）	0.5克
双蒸水	不适用	高达 500 毫升

室温保存。

脱色液 (500 mL)

试剂最终浓度数量

甲醇（100%） 40%（体积/体积） 200毫升

乙酸（100%） 8%（体积/体积） 40毫升

双蒸水不适用高达 500 毫升

室温保存。

10× PCR 缓冲液 (25 mL)

试剂	最终浓度	数量
Tris-HCl（1.5 M，pH 8.8）	200毫米	3.3毫升
氯化钾 (1 M)	100毫米	2.5毫升
(NH ₄ ) ₂ SO ₄ (1 M)	100毫米	2.5毫升
MgSO ₄ (1 M)	20毫米	0.5毫升
海卫一 X-100 (10%)	1%（体积比）	2.5毫升
无核酸酶 BSA (100 mg/mL)	1毫克/毫升	0.25毫升
双蒸水	不适用	高达 25 毫升

过滤灭菌，等分，并储存在-20°C。

实验室用品

100 mm 细胞培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：Z755923-150EA）
50 mL 管（Abdos，目录号：P10424）
1.5 mL 管（Abdos，目录号：P10202）

设备

微量移液器 10、100、200 和 1,000 µL（任何品牌）
轨道摇床（任何品牌）
涡旋混合器（Thermo Fisher Scientific，目录号：128101）
水浴（MAC血清水浴，目录号：MSW-273）
培养箱（任何品牌）
离心机（任何品牌）
生物安全柜（MAC水平层流工作台，目录号：MSW-161）
PCR机（Thermo Fisher Scientific，型号：Veriti ^TM 96孔快速热循环仪）
琼脂糖凝胶装置（Bio-Rad，目录号：1703940）
蛋白质电泳系统（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN®Tetra ^cell，目录号：1658005EDU）
可见分光光度计（Labman，型号：LMSP-V320）
高压灭菌器（任何品牌）
紫外透照仪（任何品牌）
Quantus 荧光计（Promega，目录号：E6150）

程序

BL21 (DE3) pLysS 细胞的转化
1. 将 1 μL (10–25 ng) pET-28b-Pfu-Sso7d 质粒与 50 μL BL21 (DE3) pLysS 感受态细胞在微量离心管中混合，并将混合物在冰上孵育 20–30 分钟。
2. 将转化管在 42°C 下热激 45 秒。
3. 将管子放回冰上 2 分钟。
4. 将 500 μL 预热的超优分解代谢物 (SOC) 培养基（不含抗生素）添加到感受态细胞中，并在 37 °C 摇床培养箱中生长 30–60 分钟。
5. 将 100–200 μL 转化物接种到含有卡那霉素 (50 μg/mL) 和氯霉素 (35 μg/mL) 的 LB 琼脂平板上。
6. 将板在 37°C 下孵育过夜。

Pfu-Sso7d 在 BL21 (DE3) pLysS 细胞中的表达
1. 在含有卡那霉素 (50 μg/mL) 和氯霉素 (35 μg/mL) 的 2 mL LB 培养基中培养单个转化菌落，并在 37°C 下以 200–250 rpm 持续摇动过夜。
  
  注意：培养物的甘油储备可以储存在-80°C。
2. 将过夜起始培养物的 1 mL 等分试样接种到 100 mL 含有卡那霉素 (50 μg/mL) 和氯霉素 (35 μg/mL) 的 LB 培养基中，并在 37 °C 下以 200–250 rpm 持续摇动。
3. 当培养物在 600 nm (OD ₆₀₀ ) 处的光密度达到 0.4–0.5 时，添加 0.5 mM IPTG 并在 18 °C 下持续摇动孵育培养物过夜。

热澄清裂解液的制备
1. 在 4°C 下以 2,000× g离心15 分钟收获细菌细胞。
2. 用 5 mL 的 PBS 缓冲液清洗细胞沉淀，然后将其重新悬浮在 4.5 mL 新鲜补充有 0.5 mM PMSF 和 2 mg/mL 溶菌酶的裂解缓冲液中。
3. 37°C 孵育 30 分钟，偶尔混合。
4. 短暂旋转样品管，然后将管在 70°C 下加热 30 分钟。
5. 将其置于冰上 15 分钟，将裂解物以 13,500× g离心10 分钟，并将上清液收集在新管中。
6. 添加 DNase I 和 MgCl ₂至终浓度分别为 40 U/mL 和 2 mM。
7. 将管在 37°C 孵育 30 分钟。
8. 短暂旋转样品管并将管在 70°C 下加热 30 分钟。
9. 13,500× g离心10 分钟，并将上清液转移至新管中。
10. 保存一部分热澄清的裂解液，以在 SDS-PAGE 上检查热变性的纯度和效率。

丙酮沉淀法
1. 以 1:1 (v/v) 比例（最终 50%）添加冰冷的丙酮，并将管保持在 -20°C 20 分钟。
2. 13,500× g离心20 分钟，小心弃去上清液。将管子放在纸巾上轻拍以除去任何剩余的上清液。如果需要，保存一部分上清液以检查丙酮沉淀效率。
3. 添加 2–3 mL 新鲜补充有 2 mM DTT 的存储缓冲液。
4. 剧烈涡旋管并在-20°C 下放置过夜。
5. 将样品以 2,500× g离心5 分钟。收集上清液，等分，并储存在-20°C或-80°C。
6. 如有必要，可以使用 1-2 mL 存储缓冲液再次提取沉淀，并重复步骤 D3 和 D5。
7. 保存一部分沉淀和溶解的聚合酶，以在 SDS-PAGE 上检查纯度和丙酮沉淀效率。

乙醇沉淀法
1. 以 1:2 (v/v) 比例（最终 67%）添加乙醇，并将管在室温下放置 20 分钟。
2. 13,500× g离心20 分钟，小心弃去上清液。将管子放在纸巾上轻拍以除去任何剩余的上清液。如果需要，保存一部分上清液以检查乙醇沉淀效率。
3. 添加 2–3 mL 新鲜补充有 2 mM DTT 的存储缓冲液。
4. 剧烈涡旋管并在-20°C 下放置过夜。
5. 将样品以 2,500× g离心5 分钟。收集上清液，等分，并储存在-20°C或-80°C。
6. 如有必要，可以用 1-2 mL 存储缓冲液再次提取沉淀，并重复步骤 E3 和 E5。
7. 保存一部分沉淀和溶解的聚合酶，以在 SDS-PAGE 上检查纯度和乙醇沉淀效率。

纯化的 Pfu-Sso7d 的分析
1. 将上面保存的 10–20 μL 各种样品进行 SDS-PAGE（10% 分离胶，5% 堆积）运行，并用考马斯亮蓝 R-250 染色。
2. 进行 PCR 时，将 1×自制或市售 PCR 缓冲液、200 nM 引物、0.2 mM dNTP、0.1–0.5 μL 聚合酶、0.7–1.5 M 甜菜碱和适量 DNA 模板（基因组 DNA：50–250 ng；质粒或病毒 DNA：10 pg–20 ng；cDNA：最多 5 µL），总反应体积为 25–50 µL，进行 30–35 个循环。执行 PCR，初始变性在 95°C 30 秒，然后在 95°C 变性 10 秒 25-35 个循环，引物在 45-72°C 退火 10-20 秒，在 72°C 延伸（ 2 kb/min)，最后在 72 °C 下延伸 5 分钟。
3. 将 PCR 产物在含有 1 μg/mL 溴化乙锭的 0.8%–2.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳，并在紫外照明下可视化分离的 PCR 产物。
4. 稀释丙酮和乙醇沉淀和溶解的聚合酶的级分，并使用二辛可宁酸（BCA）方法估计蛋白质。蛋白质浓度一般在1.0~4.0 μg/μL范围内。

协议验证

该协议已在以下研究文章中使用和验证：

法鲁基等人。[5]。快速简便地提取和纯化 Pfu-Sso7d（一种高持续活性 DNA 聚合酶）的方法。蛋白质表达和纯化。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

丙酮和乙醇都可以有效沉淀 Pfu-Sso-7d，但我们建议使用丙酮而不是乙醇，因为与乙醇 (67%) 相比，前者显示出相对较少量的污染 DNA，并且需要较少量的丙酮 (50%)。
虽然我们已经进行了热休克方法将质粒DNA转化到大肠杆菌中，但是也可以遵循其他转化方法。
按照建议制备和储存时，所有缓冲液均可稳定保存长达一年；通过该方案制备并按所述储存的聚合酶可保持稳定长达三年。我们没有在上述时间之外对它们进行测试。

故障排除

如果您发现在 -20 °C 或 -80 °C 下长期储存导致活性损失，可以通过在 Pfu-Ss07d 溶液中添加 2 mM 新鲜 DTT 来恢复。

致谢

我们感谢印度政府科学技术部科学与工程研究委员会 (SRG-2020-000819) 和大学教育资助委员会 [F.30-564/2021 (BSR)] 的财政支持，通过启动研究补助金。该协议改编自 Farooqui 等人。[5]。

利益争夺

作者声明不存在竞争的经济利益。

参考

王勇（2004）。一种设计 DNA 聚合酶的新策略，以增强持续加工能力并改善体外性能。 核酸研究。32（3）：1197-1207。
Gera, N.、Hussain, M.、Wright, RC 和 Rao, BM (2011)。来自超嗜热 Sso7d 支架的高度稳定的结合蛋白。 J.莫尔。生物。409（4）：601-616。
Dabrowski, S. 和 Kur, J. (1998)。重组组氨酸标签 DNA 聚合酶。I. 嗜热栖热菌重组 DNA 聚合酶的克隆、纯化和部分表征。生物化学学报。波尔。45（3）：653-660。
Rivera, M.、Reyes, J.、Blazquez-Sanchez, P. 和 A Ramirez-Sarmiento, C. (2021)。密码子优化的 Pfu-Sso7d v2 的重组蛋白表达和纯化。土井：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bzusp6we。
Farooqui, AK、Ahmad, H.、Rehmani, MU 和 Husain, A. (2023)。快速简便地提取和纯化 Pfu-Sso7d（一种高持续活性 DNA 聚合酶）的方法。 蛋白质实验普里夫。208–209：106276。