材料与试剂

1.5 mL采样管（WATSON，目录号：131-8155C）
螺旋口试管（ Maruemu ，目录号：NR-10）
强大的小瓶（ Maruemu ，目录号：84-0561）
TORAST 小瓶（岛津 GLC，目录号：GLCTV-902）
TORAST 样品瓶插入件（Shimadzu GLC，目录号：GLCTV-I04）
TORAST 小瓶盖（Shimadzu GLC，目录号：GLCTV-903）
己烷（Fuji Film Wako，目录号：085-00416）
2-丙醇（Fuji Film Wako，目录号：166-04836）
二丁基羟基甲苯（BHT）（Fuji Film Wako，目录号：029-07392）
氮气
氦气
氩气
氯仿（Fuji Film Wako，目录号：038-02606）
乙醇（Fuji Film Wako，目录号：057-00456）
Milli-Q 水
吡啶（Fuji Film Wako，目录号：161-18453）
注意：将吡啶保存在装有硅胶的干燥器中，室温保存，开封后四个星期内使用。
N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）（GL Science，目录号：1022-11061）
胆固醇（纯度≥99%）（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
胆固醇-d7（纯度≥ 99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700041P）
去莫甾醇（纯度≥99％）（Nagara Science，目录号：NS460402）
羊毛甾醇（纯度≥99.5%）（Nagara Science，目录号：NS460102）
Lathosterol （纯度≥99％）（Nagara Science，目录号：NS460502）
7-脱氢胆固醇（纯度≥95%）（Sigma-Aldrich，目录号：30800）
24,25-环氧胆固醇（纯度≥95%）（Abcam，目录号：Ab141633）
24,25-二氢羊毛甾醇（纯度≥99.5%）（Nagara Science，目录号：NS460201）
4 β-羟基胆固醇（纯度≥95%）（开曼，目录号：19518）
7 α-羟基胆固醇（纯度≥99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700034P）
7 β-羟基胆固醇（纯度≥95%）（Sigma-Aldrich，目录号：H6891）
7 α ,25-二羟基胆固醇（纯度≥98%）（Sigma-Aldrich，目录号：SML0541）
7 α ,27-二羟基胆固醇（纯度≥ 99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700024P）
25-羟基胆固醇（纯度≥98%）（Sigma-Aldrich，目录号：H1015）
24（S）-羟基胆固醇（纯度≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：SML1648）
25-羟基胆固醇-d6（Avanti Polar Lipids，目录号：LM4113-1EA）
27-羟基胆固醇（纯度≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：SML2042）
氯化钠（Fuji Film Wako，目录号：196-01665）
氯化钾（SIGMA，目录号：P9541）
水合磷酸氢二钠（Fuji Film Wako，目录号：196-02835）
磷酸二氢钾（Fuji Film Wako，目录号：196-04245）
氢氧化钾（Fuji Film Wako，目录号：168-21815）
氢氧化钠（Fuji Film Wako，目录号：192-15985）
D-MEM/Ham's F-12 含 L-谷氨酰胺和酚红（Fuji Film Wako，目录号：048-29785）
RPMI-1640 含 L-谷氨酰胺和酚红（Fuji Film Wako，目录号：189-02025）
Opti-MEM TM I 减少血清培养基（ Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
胎牛血清（FBS）（批号：27419002）（Corning，目录号：35-079-CF ）
青霉素G钾（Meiji Seika Pharma，目录号：6111400D3051）
硫酸链霉素（Meiji Seika Pharma，目录号：6161400D1034）
Lipofectamine LTX 试剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15338100）
盐酸强力霉素（LKT Labs，目录号：D5897）
Kdo2-Lipid A（Avanti Polar Lipids，目录号：69500P）
Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）

生物材料

CHO-K1 细胞（达特茅斯大学 Geisel 医学院 Ta-Yuan Chang 博士赠送）
CHO -CH25H tet-on细胞（Saito 等， 2023）
J774.1细胞（RIKEN细胞库，目录号：RCB0434 ）
编码胆固醇羟化酶的表达质粒（Saito et al. , 2023）：pFLAG-CH25H、pCYP27A1-FLAG、pCYP46A1-FLAG 和 pCYP7A1-FLAG
原始论文中描述了CHO -CH25H tet-on细胞和四种羟化酶表达质粒的详细信息（Saito 等人，2023）。

解决方案

70% 乙醇（参见配方）
75% 乙醇（参见配方）
10 N KOH（溶解在 75% 乙醇中）（参见配方）
己烷/2-丙醇 (3:2) 与 0.01% BHT（参见配方）
0.1 N NaOH（参见配方）
PBS（参见食谱）

食谱

70%乙醇
试剂体积
乙醇（绝对）35毫升
水分子_15毫升
全部的50毫升

75%乙醇
试剂体积
乙醇（绝对）37.5毫升
水分子_12.5毫升
全部的50毫升

10 N KOH（溶于75%乙醇）
试剂数量
氢氧化钾28.1克
75%乙醇高达 50 毫升
全部的50毫升

己烷/2-丙醇 (3:2)，含 0.01% BHT
试剂数量
己烷60毫升
2-丙醇40毫升
二丁基羟基甲苯10毫克
全部的100毫升

0.1N 氢氧化钠
试剂数量
氢氧化钠0.2克
水分子_高达 50 毫升
全部的50毫升

公共广播公司
试剂数量
氯化钠_8克
氯化钾0.2克
十二水磷酸氢二钠3.6克
磷酸二氢钾G
水分子_最多 1 升
氢氧化钠1升

设备

配有自动进样器 (AOC-20i) 的 GC–MS/MS（岛津制作所，型号：GCMS-TQ8040NX）
BPX5 GC 毛细管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm ）（TRAJAN，目录号：SGE-054101）
Rxi保护柱（5 m × 0.25 mm）（ Restek ，目录号：10029）
Eppendorf ThermoMixer C（Eppendorf，目录号：5382000023）
Hamilton 微量注射器 710RN（Hamilton，目录号：72-5004）
加压吹气浓缩器（EYELA，型号：MGS-2200）
铝块 MGB-1540（EYELA，目录号：207580）
铝块 MGB-1624（EYELA，目录号：207610）
低速冷冻离心机（TOMY，型号：AX-511）
SpectraMax （Molecular Devices，型号：M2e）

软件和数据集

GC -MSsolution v4（岛津）
RStudio软件（定位）
GraphPad Prism 9（GraphPad）

程序

细胞培养

表达胆固醇羟化酶的CHO-K1细胞的制备
× 10 5 个细胞的密度一式三份接种到 6 孔板中，并在补充有 7.5% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素的 DMEM/Ham's F-12 培养基中孵育（ 0.1 mg/mL ) 在 37 °C和 5% CO 2下 18–24 小时。
转染前 2-3 小时将培养基更换为 Opti-MEM。
根据制造商的方案，使用 Lipofectamine LTX 试剂，用2 μg编码 CH25H、CYP7A1、CYP27A1 或 CYP46A1（分别为 pFLAG-CH25H、pCYP7A1-FLAG、pCYP27A1-FLAG 或 pCYP46A1-FLAG）的质粒转染细胞。
注意：这四种羟化酶表达构建体在原始论文中进行了描述（Saito 等人，2023）。
转染后 5 小时，将培养基更改为含有 0.1% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（ 0.1 mg/mL ）的 DMEM/Ham's F-12 培养基。
在收获细胞进行脂质提取之前，将细胞在37℃和5%CO 2下孵育24小时。

CHO-CH25H tet-on细胞的制备
板 2 × 10 5 将 CHO-CH25H tet-on细胞一式三份放入 6 孔板的孔中，并在含有 7.5% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（ 0.1 ）的 DMEM/Ham's F-12 培养基中孵育18-24 小时mg/mL ) 在 37 °C和 5% CO 2下。
在含有 0.1% FBS 和青霉素/链霉素的DMEM/Ham's F-12 培养基中用或不用 0.4 或 1 μg /mL 盐酸强力霉素处理细胞 24小时，诱导 FLAG-CH25H 表达并收获细胞以提取细胞脂质。

J774.1细胞的制备
将 J774.1 细胞以每孔5 × 10 5 个细胞的密度一式三份接种到 6 孔板中，并在补充有 10% FBS 和青霉素/链霉素，37 ℃，5% CO 2 。
将细胞在含有或不含100 ng/mL Kdo2-Lipid A（一种 Toll 样受体 4 配体）的情况下，在含有 10% FBS 和青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基中于 37℃ 孵育 20 小时，然后提取细胞脂质。

细胞脂质的提取

用 PBS（1.5 mL/孔）在 6 孔板中清洗细胞两次，并让细胞在室温下干燥。
将 1.5 mL/孔的己烷/2-丙醇 (3:2) 和 0.01% BHT（参见配方）添加到 6 孔板中室温放置1小时以提取细胞脂质。
将己烷/2-丙醇收集到玻璃管（螺旋顶试管）中。
将 1 mL/孔的己烷/2-丙醇 (3:2) 和 0.01% BHT 添加到同一孔中，并在室温下放置 30 分钟。
将己烷/2-丙醇转移到同一玻璃管中以汇集提取的细胞脂质。
将胆固醇-d7（氯仿中 5 μg /mL 库存中的 100 ng /管）和 25-羟基胆固醇-d6（甲醇中 1 μg / mL库存中的 10 ng/管）添加到每个样品中作为内部对照。
使用加压吹气浓缩器 MGS-2200在室温下在氮气流下蒸发有机溶剂。
加入 1 mL 100% 乙醇和 300 μL 10 N KOH（溶解在 75% 乙醇中）（参见配方），用螺旋杯封闭，轻轻混匀。
将管在 80 °C下孵育1 小时以皂化脂质。
在冰上冷却管子。
将 2 mL 氯仿添加到每个管中并涡旋。
将 2.5 mL 蒸馏水加入每个管中并涡旋。
× g离心管使用低速冷冻离心机 AX-511在室温下离心 10 分钟。
使用吸气器除去水相（上层）。
再次向每个管中加入 2 mL 蒸馏水，并涡旋 1 分钟。
× g离心管室温放置 10 分钟。
使用吸气器再次除去水层。
再次向每个管中加入 2 mL 蒸馏水，涡旋，并在室温下以2,380 × g离心 10 分钟。
使用吸气器除去水层。
巴斯德移液器将氯仿相（含有非皂化脂质，包括甾醇）转移到新的玻璃瓶（ Mighty Vials）中，并在氮气流下干燥。

提取的细胞甾醇的衍生化

将 50 μL吡啶和 50 μL MSTFA添加到每个小瓶中并轻轻混合。
使用 Eppendorf ThermoMixer C将小瓶在 80 °C下孵育 1 小时，并以 300 rpm 的转速搅拌。
使用 Hamilton 微量注射器将衍生样品转移到带有 TORAST 小瓶插入物的新 TORAST 小瓶中，并用 TORAST 小瓶盖封闭管子。

标准甾醇混合物的制备

在单独的小瓶中制备两种类型的标准甾醇混合物，如下：非羟基甾醇的标准混合物含有胆固醇、胆固醇-d7、去莫甾醇、7-脱氢胆固醇、拉索甾醇、羊毛甾醇和24，25-二氢羊毛甾醇；氧甾醇含有4β-羟基胆固醇、 7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、24(S)-羟基胆固醇、 25-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇-d6、27-羟基胆固醇、 7α ，25-二羟基胆固醇、 7α ，27-二羟基胆固醇和24，25-环氧胆固醇。添加到每个小瓶中的每种甾醇的量对于非羟基甾醇混合物为0.1、1、5、10、50和100ng，对于氧甾醇混合物为0.01、0.1、0.5、1、5、10和20ng。
室温下在氮气流下干燥。
将甾醇溶解在 50 μL吡啶和 50 μL MSTFA中。
羟基甾醇混合物的终浓度为 1、10、50、100、500 和 1000 ng/mL，氧甾醇混合物的终浓度为 0.1、1、5、10、50、100和 200 ng/mL 。
使用 Eppendorf ThermoMixer C将小瓶在 80 °C下孵育 1 小时，并以 300 rpm 的转速搅拌。
使用 Hamilton 微量注射器将衍生样品转移到带有 TORAST 小瓶插入物的新 TORAST 小瓶中，并用 TORAST 小瓶盖封闭管子。

GC-MS/MS 分析

不分流模式下将 1 μL样品或标准混合物注入配备 BPX5 GC 色谱柱的 GCMS-TQ8040 NX 。详细的分析条件如表 1 所示。

表 1. GC–MS/MS 条件
气相色谱参数
注射方式不吐口水
柱子BPX5 GC 色谱柱 (30 m × 0.25 mm, 0.25 mm) Rxi保护柱 (5 m × 0.25 mm)
载气控制线速度（49.5厘米/秒）
高压注射250kPa（1分钟）
注射温度275 ℃
柱箱温度200 ℃ （1分钟）→25 ℃ /分钟→250 ℃ →15 ℃ /分钟→290 ℃ →5 ℃ /分钟→320 ℃ （2分钟）
质谱参数
界面温度280 ℃
离子源温度230 ℃
循环时间0.3秒
测量模式多反应监测（MRM）

在多反应监测 (MRM) 模式下通过 MS/MS 检测 17 种甾醇。每种甾醇的保留时间、碰撞能量、定量离子和确认离子如表 2 所示。图 2 显示了相应甾醇的 MRM 色谱图。

表 2. 甾醇分析的保留时间、定量离子、确认离子和碰撞能量 (CE)
甾醇保留时间（分钟）定量离子确认离子
MRM 离子对 (m/z)电子伏特 (eV)MRM 离子对 (m/z)电子伏特 (eV)
7α-羟基胆固醇8.48456 > 208.318456 > 119, 456 > 95.230, 33
胆固醇-d78.89336 > 121.118375 > 145.1, 336 > 109.218, 18
胆固醇8.94368 > 145.121329 > 95.1, 329 > 81.127, 24
去氨甾醇9.24129 > 7315129 > 57.9, 129 > 127.130, 15
7-脱氢胆固醇9.28351 > 145.1三十351 > 128.142
7β-羟基胆固醇9.38456 > 233.218233 > 73.124
黄甾醇9.41213 > 157.212213 > 81.115
4β-羟基胆固醇9.61366 > 158.318366 > 129.136
24,25-二氢羊毛甾醇10.01395 > 145.230395 > 10730
7 α ,25-二羟基胆固醇10.21131 > 73.118544 > 73.239
羊毛甾醇10.36393 > 95.224393 > 187.412
24,25-环氧胆固醇10.44143 > 73.118129 > 73.1, 143 > 128.115, 18
24(S)-羟基胆固醇10.60159 > 69.19159 > 73.118
7 α ,27-二羟基胆固醇10.60103 > 73.19544 > 233.233
25-羟基胆固醇-d 610.75137 > 73.215137 > 58.230
25-羟基胆固醇10.79131 > 73.29131 > 58.130
27-羟基胆固醇11.26129 > 73.115456 > 131.2, 417 > 6942, 42

笔记：
胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6 分别作为非羟基化甾醇和羟基化甾醇的内标。
定量离子用于识别和计算每种甾醇的量。确认离子用于帮助识别相应的甾醇。几种甾醇共享相同的前体离子、定量离子和确认离子。当这些甾醇未分离时，应选择不同的前体离子进行鉴定和定量。
用于定量的母离子和确认离子根据以下标准仔细确定：更高的 m/z 和更强的强度。碰撞能量由仪器自动计算。
切割柱进行维护后，每种甾醇的保留时间会变短，因为这取决于柱长度。

细胞蛋白测定

细胞脂质提取（步骤 B5）后，向每个孔中添加 1 mL 0.1 N NaOH（参见配方），并在室温下放置 20-24 小时以溶解细胞蛋白质。
使用移液器混合溶解的蛋白质，并将 10 μL样品转移至 96 孔板的孔中。
添加 150 μL BCA 测定试剂，在 37 ° C下孵育板 30 分钟，并使用读板器 ( SpectraMax M2e) 记录 562 nm 处的吸光度。
以牛血清白蛋白为标准品测定样品的蛋白浓度。

图 2. 本方案中分析的甾醇的多反应监测 (MRM) 色谱图。每种甾醇的 MRM 色谱图根据保留时间显示。每个色谱图中均显示了定量离子（黑色）和确认离子（粉色和蓝色）。黑线、粉色线和蓝色线分别表示定量离子和确认离子。

数据分析

MSsolution v4 软件获得每个甾醇峰面积。
使用 GC- MSsolution创建每种甾醇的标准曲线。各个甾醇的典型标准曲线如补充图 1所示。
根据峰面积和标准曲线，使用 GC- MS溶液测定样品中每种甾醇的浓度。
注：如程序 D 中所述，两条标准曲线的范围如下：非羟基甾醇为 1 ng/mL 至 1 μg /mL ，氧化甾醇为 0.1 ng/mL 至 200 ng/mL。
使用以下方程计算胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6的提取效率：

E=(C × V × 1000)/(I )

其中E是提取效率， C是GC-MS/MS检测到的胆固醇-d7或25-羟基胆固醇-d6的浓度（ μg /mL ），V是样品的最终体积（mL）（本例中为0.1mL）方案）， I是在步骤 B6 中添加的内标的数量（ng）（在本方案中为 100 ng胆固醇-d7 或 10 ng 25-羟基胆固醇-d6）。
使用适当的提取效率计算每个样品中每种甾醇的原始含量。
胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6的提取效率分别用于计算非羟基甾醇和氧化甾醇的原始量。
将每孔每种甾醇与细胞蛋白的量标准化（图3）。
所有数据均由至少三个独立生物重复的平均值±SD 表示。使用 RStudio 软件通过Student t检验或采用 Dunnett 或 Tukey-Kramer 事后检验的单向方差分析进行统计分析。 p < 0.05 被认为具有统计显着性。

优点和局限性
LC-MS/MS、GC-MS 和 GC-MS/MS 已用于甾醇分析，其中 GC-MS 是最传统的技术（Krone 等人。，2010；麦克唐纳等人， 2012；格里菲斯等人， 2013；齐藤等人， 2023）。尽管每种方法都有优点和局限性，但上述当前 GC-MS/MS 协议与其他方法相比具有多个优点。由于我们的方法高度灵敏，可以检测到 1 pg的甾醇，因此从 6 孔板的孔中的细胞（大约 0.5–1 × 10 6个细胞）中提取的脂质足以测量一系列甾醇，包括氧甾醇和中间体甾醇。当前细胞甾醇的 GC-MS/MS 分析比我们之前使用 GC-MS 的分析更加灵敏，其中细胞脂质是从 100 mm 培养皿或整个 6 孔板中提取的（Yamauchi 等人。，2007），而检测到的细胞甾醇含量的量是相等的。因此，可以同时处理许多样品，以便在单次测定中研究多个实验条件。此外，我们方法中样品的运行时间约为 15 分钟。 GC-MS 和 LC-MS/MS 甾醇分析的典型运行时间分别为 20-30 分钟和 12-20 分钟，具体取决于所使用的色谱柱和条件。因此，我们的 GC-MS/MS 方法在运行时间方面与 LC-MS/MS 分析相当。
此外，基于 GC 的方法通常比 LC-MS/MS 具有更好的色谱分辨率。之前的 LC-MS/MS 方法无法解析 7α-HC 和 7β-HC（麦当劳等人， 2012），而我们的 GC-MS/MS 协议区分了这两种氧甾醇（Saito等人， 2023）。因此，GC-MS/MS 是分析少量异构氧化甾醇的卓越技术，而 LC-MS/MS 方法的主要限制是此类氧化甾醇往往会提供相似的光谱。
然而，基于 GC-MS/MS 的甾醇分析也有缺点。与 LC-MS/MS 方法相反，后者通常不需要衍生化（McDonald 等人。，2012），甾醇需要进行衍生化才能进行 GC-MS/MS 分析，这是一个费力且耗时的过程。此外，由于 GC-MS/MS 与 LC-MS/MS 一样采用 MRM 模式检测目标化合物，因此只能测量具有可用标准的目标分子。
总之，当前的 GC-MS/MS 方案提供了一种快速且高度灵敏的方法，用于定量细胞内内源合成的一系列氧甾醇，定量测定胆固醇羟化酶活性。

图 3. 通过 GC-MS/MS 全面定量测定活细胞中胆固醇羟化酶合成的氧甾醇。 ( A)强制表达 CH25H、CYP27A1、CYP46A1 或 CYP7A1 的C HO-K1 细胞中的氧甾醇含量。数据显示，CH25H和CYP7A1分别对合成25-HC和7α - HC具有很强的特异性，而CYP27A1和CYP46A1表现出更广泛的特异性； CYP27A1不仅产生27-HC，还产生25-HC，CYP46A1除了合成24(S)-HC外，还合成25-HC和27-HC。 (B) CH25H 表达水平依赖性 25-HC 的产生及其对 CH25H tet-on 细胞中中间甾醇含量的影响。多西环素 (Dox) 以剂量依赖性方式诱导 25-HC 合成，从而导致中间甾醇含量减少。 24,25-DHL、24,25-二氢羊毛甾醇； 7-DHC，7-脱氢胆固醇。 (C)用或不用 100 ng/mL Kdo2-Lipid A (K LA ) 处理 20 小时的 J774.1 鼠巨噬细胞中的25-HC 和 7 α ,25-diHC 含量。用 K LA刺激细胞诱导 CH25H 的表达以及 25-HC 和7α ,25-diHC的产生。统计分析通过单向方差分析与 Dunnett 事后检验 (B) 或学生t检验 (C) 进行（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。该图中提供的数据复制自原始论文（Saito 等人，2023）。

致谢

这是 Saito 等人报告的 GC-MS/MS 分析的详细方案。（2023）。我们感谢 Misato Takata 女士协助维护我们的 GC-MS/MS 机器。该研究得到了日本医学研究与发展机构 (AMED)-CREST 拨款 20gm091008h 和 21gm091008h（授予 YY 和 RS）、KAKENHI 拨款 19H02908 和 22H02281（授予 YY）和 20H00408 的支持（对RS）来自日本学术振兴会的资助，以及来自朝日集团基金会（对YY）的研究资助。 HS得到了日本学术振兴会青年科学家研究奖学金（20J10181）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

道德考虑

这项研究不包括人类或动物受试者。

参考

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材料与试剂

1.5 mL采样管（WATSON，目录号：131-8155C）
螺旋口试管（ Maruemu ，目录号：NR-10）
强大的小瓶（ Maruemu ，目录号：84-0561）
TORAST 小瓶（岛津 GLC，目录号：GLCTV-902）
TORAST 样品瓶插入件（Shimadzu GLC，目录号：GLCTV-I04）
TORAST 小瓶盖（Shimadzu GLC，目录号：GLCTV-903）
己烷（Fuji Film Wako，目录号：085-00416）
2-丙醇（Fuji Film Wako，目录号：166-04836）
二丁基羟基甲苯（BHT）（Fuji Film Wako，目录号：029-07392）
氮气
氦气
氩气
氯仿（Fuji Film Wako，目录号：038-02606）
乙醇（Fuji Film Wako，目录号：057-00456）
Milli-Q 水
吡啶（Fuji Film Wako，目录号：161-18453）
注意：将吡啶保存在装有硅胶的干燥器中，室温保存，开封后四个星期内使用。
N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）（GL Science，目录号：1022-11061）
胆固醇（纯度≥99%）（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
胆固醇-d7（纯度≥ 99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700041P）
去莫甾醇（纯度≥99％）（Nagara Science，目录号：NS460402）
羊毛甾醇（纯度≥99.5%）（Nagara Science，目录号：NS460102）
Lathosterol （纯度≥99％）（Nagara Science，目录号：NS460502）
7-脱氢胆固醇（纯度≥95%）（Sigma-Aldrich，目录号：30800）
24,25-环氧胆固醇（纯度≥95%）（Abcam，目录号：Ab141633）
24,25-二氢羊毛甾醇（纯度≥99.5%）（Nagara Science，目录号：NS460201）
4 β-羟基胆固醇（纯度≥95%）（开曼，目录号：19518）
7 α-羟基胆固醇（纯度≥99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700034P）
7 β-羟基胆固醇（纯度≥95%）（Sigma-Aldrich，目录号：H6891）
7 α ,25-二羟基胆固醇（纯度≥98%）（Sigma-Aldrich，目录号：SML0541）
7 α ,27-二羟基胆固醇（纯度≥ 99%）（Avanti Polar Lipids，目录号：700024P）
25-羟基胆固醇（纯度≥98%）（Sigma-Aldrich，目录号：H1015）
24（S）-羟基胆固醇（纯度≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：SML1648）
25-羟基胆固醇-d6（Avanti Polar Lipids，目录号：LM4113-1EA）
27-羟基胆固醇（纯度≥98％）（Sigma-Aldrich，目录号：SML2042）
氯化钠（Fuji Film Wako，目录号：196-01665）
氯化钾（SIGMA，目录号：P9541）
水合磷酸氢二钠（Fuji Film Wako，目录号：196-02835）
磷酸二氢钾（Fuji Film Wako，目录号：196-04245）
氢氧化钾（Fuji Film Wako，目录号：168-21815）
氢氧化钠（Fuji Film Wako，目录号：192-15985）
D-MEM/Ham's F-12 含 L-谷氨酰胺和酚红（Fuji Film Wako，目录号：048-29785）
RPMI-1640 含 L-谷氨酰胺和酚红（Fuji Film Wako，目录号：189-02025）
Opti-MEM TM I 减少血清培养基（ Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
胎牛血清（FBS）（批号：27419002）（Corning，目录号：35-079-CF ）
青霉素G钾（Meiji Seika Pharma，目录号：6111400D3051）
硫酸链霉素（Meiji Seika Pharma，目录号：6161400D1034）
Lipofectamine LTX 试剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15338100）
盐酸强力霉素（LKT Labs，目录号：D5897）
Kdo2-Lipid A（Avanti Polar Lipids，目录号：69500P）
Pierce BCA 蛋白质测定试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）

生物材料

CHO-K1 细胞（达特茅斯大学 Geisel 医学院 Ta-Yuan Chang 博士赠送）
CHO -CH25H tet-on细胞（Saito 等， 2023）
J774.1细胞（RIKEN细胞库，目录号：RCB0434 ）
编码胆固醇羟化酶的表达质粒（Saito et al. , 2023）：pFLAG-CH25H、pCYP27A1-FLAG、pCYP46A1-FLAG 和 pCYP7A1-FLAG
原始论文中描述了CHO -CH25H tet-on细胞和四种羟化酶表达质粒的详细信息（Saito 等人，2023）。

解决方案

70% 乙醇（参见配方）
75% 乙醇（参见配方）
10 N KOH（溶解在 75% 乙醇中）（参见配方）
己烷/2-丙醇 (3:2) 与 0.01% BHT（参见配方）
0.1 N NaOH（参见配方）
PBS（参见食谱）

食谱

70%乙醇
试剂体积
乙醇（绝对）35毫升
水分子_15毫升
全部的50毫升

75%乙醇
试剂体积
乙醇（绝对）37.5毫升
水分子_12.5毫升
全部的50毫升

10 N KOH（溶于75%乙醇）
试剂数量
氢氧化钾28.1克
75%乙醇高达 50 毫升
全部的50毫升

己烷/2-丙醇 (3:2)，含 0.01% BHT
试剂数量
己烷60毫升
2-丙醇40毫升
二丁基羟基甲苯10毫克
全部的100毫升

0.1N 氢氧化钠
试剂数量
氢氧化钠0.2克
水分子_高达 50 毫升
全部的50毫升

公共广播公司
试剂数量
氯化钠_8克
氯化钾0.2克
十二水磷酸氢二钠3.6克
磷酸二氢钾G
水分子_最多 1 升
氢氧化钠1升

设备

配有自动进样器 (AOC-20i) 的 GC–MS/MS（岛津制作所，型号：GCMS-TQ8040NX）
BPX5 GC 毛细管柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm ）（TRAJAN，目录号：SGE-054101）
Rxi保护柱（5 m × 0.25 mm）（ Restek ，目录号：10029）
Eppendorf ThermoMixer C（Eppendorf，目录号：5382000023）
Hamilton 微量注射器 710RN（Hamilton，目录号：72-5004）
加压吹气浓缩器（EYELA，型号：MGS-2200）
铝块 MGB-1540（EYELA，目录号：207580）
铝块 MGB-1624（EYELA，目录号：207610）
低速冷冻离心机（TOMY，型号：AX-511）
SpectraMax （Molecular Devices，型号：M2e）

软件和数据集

GC -MSsolution v4（岛津）
RStudio软件（定位）
GraphPad Prism 9（GraphPad）

程序

细胞培养

表达胆固醇羟化酶的CHO-K1细胞的制备
× 10 5 个细胞的密度一式三份接种到 6 孔板中，并在补充有 7.5% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素的 DMEM/Ham's F-12 培养基中孵育（ 0.1 mg/mL ) 在 37 °C和 5% CO 2下 18–24 小时。
转染前 2-3 小时将培养基更换为 Opti-MEM。
根据制造商的方案，使用 Lipofectamine LTX 试剂，用2 μg编码 CH25H、CYP7A1、CYP27A1 或 CYP46A1（分别为 pFLAG-CH25H、pCYP7A1-FLAG、pCYP27A1-FLAG 或 pCYP46A1-FLAG）的质粒转染细胞。
注意：这四种羟化酶表达构建体在原始论文中进行了描述（Saito 等人，2023）。
转染后 5 小时，将培养基更改为含有 0.1% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（ 0.1 mg/mL ）的 DMEM/Ham's F-12 培养基。
在收获细胞进行脂质提取之前，将细胞在37℃和5%CO 2下孵育24小时。

CHO-CH25H tet-on细胞的制备
板 2 × 10 5 将 CHO-CH25H tet-on细胞一式三份放入 6 孔板的孔中，并在含有 7.5% FBS、青霉素（100 单位/mL）和链霉素（ 0.1 ）的 DMEM/Ham's F-12 培养基中孵育18-24 小时mg/mL ) 在 37 °C和 5% CO 2下。
在含有 0.1% FBS 和青霉素/链霉素的DMEM/Ham's F-12 培养基中用或不用 0.4 或 1 μg /mL 盐酸强力霉素处理细胞 24小时，诱导 FLAG-CH25H 表达并收获细胞以提取细胞脂质。

J774.1细胞的制备
将 J774.1 细胞以每孔5 × 10 5 个细胞的密度一式三份接种到 6 孔板中，并在补充有 10% FBS 和青霉素/链霉素，37 ℃，5% CO 2 。
将细胞在含有或不含100 ng/mL Kdo2-Lipid A（一种 Toll 样受体 4 配体）的情况下，在含有 10% FBS 和青霉素/链霉素的 RPMI-1640 培养基中于 37℃ 孵育 20 小时，然后提取细胞脂质。

细胞脂质的提取

用 PBS（1.5 mL/孔）在 6 孔板中清洗细胞两次，并让细胞在室温下干燥。
将 1.5 mL/孔的己烷/2-丙醇 (3:2) 和 0.01% BHT（参见配方）添加到 6 孔板中室温放置1小时以提取细胞脂质。
将己烷/2-丙醇收集到玻璃管（螺旋顶试管）中。
将 1 mL/孔的己烷/2-丙醇 (3:2) 和 0.01% BHT 添加到同一孔中，并在室温下放置 30 分钟。
将己烷/2-丙醇转移到同一玻璃管中以汇集提取的细胞脂质。
将胆固醇-d7（氯仿中 5 μg /mL 库存中的 100 ng /管）和 25-羟基胆固醇-d6（甲醇中 1 μg / mL库存中的 10 ng/管）添加到每个样品中作为内部对照。
使用加压吹气浓缩器 MGS-2200在室温下在氮气流下蒸发有机溶剂。
加入 1 mL 100% 乙醇和 300 μL 10 N KOH（溶解在 75% 乙醇中）（参见配方），用螺旋杯封闭，轻轻混匀。
将管在 80 °C下孵育1 小时以皂化脂质。
在冰上冷却管子。
将 2 mL 氯仿添加到每个管中并涡旋。
将 2.5 mL 蒸馏水加入每个管中并涡旋。
× g离心管使用低速冷冻离心机 AX-511在室温下离心 10 分钟。
使用吸气器除去水相（上层）。
再次向每个管中加入 2 mL 蒸馏水，并涡旋 1 分钟。
× g离心管室温放置 10 分钟。
使用吸气器再次除去水层。
再次向每个管中加入 2 mL 蒸馏水，涡旋，并在室温下以2,380 × g离心 10 分钟。
使用吸气器除去水层。
巴斯德移液器将氯仿相（含有非皂化脂质，包括甾醇）转移到新的玻璃瓶（ Mighty Vials）中，并在氮气流下干燥。

提取的细胞甾醇的衍生化

将 50 μL吡啶和 50 μL MSTFA添加到每个小瓶中并轻轻混合。
使用 Eppendorf ThermoMixer C将小瓶在 80 °C下孵育 1 小时，并以 300 rpm 的转速搅拌。
使用 Hamilton 微量注射器将衍生样品转移到带有 TORAST 小瓶插入物的新 TORAST 小瓶中，并用 TORAST 小瓶盖封闭管子。

标准甾醇混合物的制备

在单独的小瓶中制备两种类型的标准甾醇混合物，如下：非羟基甾醇的标准混合物含有胆固醇、胆固醇-d7、去莫甾醇、7-脱氢胆固醇、拉索甾醇、羊毛甾醇和24，25-二氢羊毛甾醇；氧甾醇含有4β-羟基胆固醇、 7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、24(S)-羟基胆固醇、 25-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇-d6、27-羟基胆固醇、 7α ，25-二羟基胆固醇、 7α ，27-二羟基胆固醇和24，25-环氧胆固醇。添加到每个小瓶中的每种甾醇的量对于非羟基甾醇混合物为0.1、1、5、10、50和100ng，对于氧甾醇混合物为0.01、0.1、0.5、1、5、10和20ng。
室温下在氮气流下干燥。
将甾醇溶解在 50 μL吡啶和 50 μL MSTFA中。
羟基甾醇混合物的终浓度为 1、10、50、100、500 和 1000 ng/mL，氧甾醇混合物的终浓度为 0.1、1、5、10、50、100和 200 ng/mL 。
使用 Eppendorf ThermoMixer C将小瓶在 80 °C下孵育 1 小时，并以 300 rpm 的转速搅拌。
使用 Hamilton 微量注射器将衍生样品转移到带有 TORAST 小瓶插入物的新 TORAST 小瓶中，并用 TORAST 小瓶盖封闭管子。

GC-MS/MS 分析

不分流模式下将 1 μL样品或标准混合物注入配备 BPX5 GC 色谱柱的 GCMS-TQ8040 NX 。详细的分析条件如表 1 所示。

表 1. GC–MS/MS 条件
气相色谱参数
注射方式不吐口水
柱子BPX5 GC 色谱柱 (30 m × 0.25 mm, 0.25 mm) Rxi保护柱 (5 m × 0.25 mm)
载气控制线速度（49.5厘米/秒）
高压注射250kPa（1分钟）
注射温度275 ℃
柱箱温度200 ℃ （1分钟）→25 ℃ /分钟→250 ℃ →15 ℃ /分钟→290 ℃ →5 ℃ /分钟→320 ℃ （2分钟）
质谱参数
界面温度280 ℃
离子源温度230 ℃
循环时间0.3秒
测量模式多反应监测（MRM）

在多反应监测 (MRM) 模式下通过 MS/MS 检测 17 种甾醇。每种甾醇的保留时间、碰撞能量、定量离子和确认离子如表 2 所示。图 2 显示了相应甾醇的 MRM 色谱图。

表 2. 甾醇分析的保留时间、定量离子、确认离子和碰撞能量 (CE)
甾醇保留时间（分钟）定量离子确认离子
MRM 离子对 (m/z)电子伏特 (eV)MRM 离子对 (m/z)电子伏特 (eV)
7α-羟基胆固醇8.48456 > 208.318456 > 119, 456 > 95.230, 33
胆固醇-d78.89336 > 121.118375 > 145.1, 336 > 109.218, 18
胆固醇8.94368 > 145.121329 > 95.1, 329 > 81.127, 24
去氨甾醇9.24129 > 7315129 > 57.9, 129 > 127.130, 15
7-脱氢胆固醇9.28351 > 145.1三十351 > 128.142
7β-羟基胆固醇9.38456 > 233.218233 > 73.124
黄甾醇9.41213 > 157.212213 > 81.115
4β-羟基胆固醇9.61366 > 158.318366 > 129.136
24,25-二氢羊毛甾醇10.01395 > 145.230395 > 10730
7 α ,25-二羟基胆固醇10.21131 > 73.118544 > 73.239
羊毛甾醇10.36393 > 95.224393 > 187.412
24,25-环氧胆固醇10.44143 > 73.118129 > 73.1, 143 > 128.115, 18
24(S)-羟基胆固醇10.60159 > 69.19159 > 73.118
7 α ,27-二羟基胆固醇10.60103 > 73.19544 > 233.233
25-羟基胆固醇-d 610.75137 > 73.215137 > 58.230
25-羟基胆固醇10.79131 > 73.29131 > 58.130
27-羟基胆固醇11.26129 > 73.115456 > 131.2, 417 > 6942, 42

笔记：
胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6 分别作为非羟基化甾醇和羟基化甾醇的内标。
定量离子用于识别和计算每种甾醇的量。确认离子用于帮助识别相应的甾醇。几种甾醇共享相同的前体离子、定量离子和确认离子。当这些甾醇未分离时，应选择不同的前体离子进行鉴定和定量。
用于定量的母离子和确认离子根据以下标准仔细确定：更高的 m/z 和更强的强度。碰撞能量由仪器自动计算。
切割柱进行维护后，每种甾醇的保留时间会变短，因为这取决于柱长度。

细胞蛋白测定

细胞脂质提取（步骤 B5）后，向每个孔中添加 1 mL 0.1 N NaOH（参见配方），并在室温下放置 20-24 小时以溶解细胞蛋白质。
使用移液器混合溶解的蛋白质，并将 10 μL样品转移至 96 孔板的孔中。
添加 150 μL BCA 测定试剂，在 37 ° C下孵育板 30 分钟，并使用读板器 ( SpectraMax M2e) 记录 562 nm 处的吸光度。
以牛血清白蛋白为标准品测定样品的蛋白浓度。

图 2. 本方案中分析的甾醇的多反应监测 (MRM) 色谱图。每种甾醇的 MRM 色谱图根据保留时间显示。每个色谱图中均显示了定量离子（黑色）和确认离子（粉色和蓝色）。黑线、粉色线和蓝色线分别表示定量离子和确认离子。

数据分析

MSsolution v4 软件获得每个甾醇峰面积。
使用 GC- MSsolution创建每种甾醇的标准曲线。各个甾醇的典型标准曲线如补充图 1所示。
根据峰面积和标准曲线，使用 GC- MS溶液测定样品中每种甾醇的浓度。
注：如程序 D 中所述，两条标准曲线的范围如下：非羟基甾醇为 1 ng/mL 至 1 μg /mL ，氧化甾醇为 0.1 ng/mL 至 200 ng/mL。
使用以下方程计算胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6的提取效率：

E=(C × V × 1000)/(I )

其中E是提取效率， C是GC-MS/MS检测到的胆固醇-d7或25-羟基胆固醇-d6的浓度（ μg /mL ），V是样品的最终体积（mL）（本例中为0.1mL）方案）， I是在步骤 B6 中添加的内标的数量（ng）（在本方案中为 100 ng胆固醇-d7 或 10 ng 25-羟基胆固醇-d6）。
使用适当的提取效率计算每个样品中每种甾醇的原始含量。
胆固醇-d7 和 25-羟基胆固醇-d6的提取效率分别用于计算非羟基甾醇和氧化甾醇的原始量。
将每孔每种甾醇与细胞蛋白的量标准化（图3）。
所有数据均由至少三个独立生物重复的平均值±SD 表示。使用 RStudio 软件通过Student t检验或采用 Dunnett 或 Tukey-Kramer 事后检验的单向方差分析进行统计分析。 p < 0.05 被认为具有统计显着性。

优点和局限性
LC-MS/MS、GC-MS 和 GC-MS/MS 已用于甾醇分析，其中 GC-MS 是最传统的技术（Krone 等人。，2010；麦克唐纳等人， 2012；格里菲斯等人， 2013；齐藤等人， 2023）。尽管每种方法都有优点和局限性，但上述当前 GC-MS/MS 协议与其他方法相比具有多个优点。由于我们的方法高度灵敏，可以检测到 1 pg的甾醇，因此从 6 孔板的孔中的细胞（大约 0.5–1 × 10 6个细胞）中提取的脂质足以测量一系列甾醇，包括氧甾醇和中间体甾醇。当前细胞甾醇的 GC-MS/MS 分析比我们之前使用 GC-MS 的分析更加灵敏，其中细胞脂质是从 100 mm 培养皿或整个 6 孔板中提取的（Yamauchi 等人。，2007），而检测到的细胞甾醇含量的量是相等的。因此，可以同时处理许多样品，以便在单次测定中研究多个实验条件。此外，我们方法中样品的运行时间约为 15 分钟。 GC-MS 和 LC-MS/MS 甾醇分析的典型运行时间分别为 20-30 分钟和 12-20 分钟，具体取决于所使用的色谱柱和条件。因此，我们的 GC-MS/MS 方法在运行时间方面与 LC-MS/MS 分析相当。
此外，基于 GC 的方法通常比 LC-MS/MS 具有更好的色谱分辨率。之前的 LC-MS/MS 方法无法解析 7α-HC 和 7β-HC（麦当劳等人， 2012），而我们的 GC-MS/MS 协议区分了这两种氧甾醇（Saito等人， 2023）。因此，GC-MS/MS 是分析少量异构氧化甾醇的卓越技术，而 LC-MS/MS 方法的主要限制是此类氧化甾醇往往会提供相似的光谱。
然而，基于 GC-MS/MS 的甾醇分析也有缺点。与 LC-MS/MS 方法相反，后者通常不需要衍生化（McDonald 等人。，2012），甾醇需要进行衍生化才能进行 GC-MS/MS 分析，这是一个费力且耗时的过程。此外，由于 GC-MS/MS 与 LC-MS/MS 一样采用 MRM 模式检测目标化合物，因此只能测量具有可用标准的目标分子。
总之，当前的 GC-MS/MS 方案提供了一种快速且高度灵敏的方法，用于定量细胞内内源合成的一系列氧甾醇，定量测定胆固醇羟化酶活性。

图 3. 通过 GC-MS/MS 全面定量测定活细胞中胆固醇羟化酶合成的氧甾醇。 ( A)强制表达 CH25H、CYP27A1、CYP46A1 或 CYP7A1 的C HO-K1 细胞中的氧甾醇含量。数据显示，CH25H和CYP7A1分别对合成25-HC和7α - HC具有很强的特异性，而CYP27A1和CYP46A1表现出更广泛的特异性； CYP27A1不仅产生27-HC，还产生25-HC，CYP46A1除了合成24(S)-HC外，还合成25-HC和27-HC。 (B) CH25H 表达水平依赖性 25-HC 的产生及其对 CH25H tet-on 细胞中中间甾醇含量的影响。多西环素 (Dox) 以剂量依赖性方式诱导 25-HC 合成，从而导致中间甾醇含量减少。 24,25-DHL、24,25-二氢羊毛甾醇； 7-DHC，7-脱氢胆固醇。 (C)用或不用 100 ng/mL Kdo2-Lipid A (K LA ) 处理 20 小时的 J774.1 鼠巨噬细胞中的25-HC 和 7 α ,25-diHC 含量。用 K LA刺激细胞诱导 CH25H 的表达以及 25-HC 和7α ,25-diHC的产生。统计分析通过单向方差分析与 Dunnett 事后检验 (B) 或学生t检验 (C) 进行（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。该图中提供的数据复制自原始论文（Saito 等人，2023）。

致谢

这是 Saito 等人报告的 GC-MS/MS 分析的详细方案。（2023）。我们感谢 Misato Takata 女士协助维护我们的 GC-MS/MS 机器。该研究得到了日本医学研究与发展机构 (AMED)-CREST 拨款 20gm091008h 和 21gm091008h（授予 YY 和 RS）、KAKENHI 拨款 19H02908 和 22H02281（授予 YY）和 20H00408 的支持（对RS）来自日本学术振兴会的资助，以及来自朝日集团基金会（对YY）的研究资助。 HS得到了日本学术振兴会青年科学家研究奖学金（20J10181）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

道德考虑

这项研究不包括人类或动物受试者。

参考

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